[发明专利]一种可克隆微藻启动子的T载体的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种可克隆微藻启动子的T载体的制备方法及应用，其步骤是：先通过PCR获得间隔序列，引入限制性内切酶识别位点；将该间隔序列连入突变了Eam1105I位点的pSP124载体，分别构建前T载体；引入ble基因作为筛选基因；通过酶切，电泳分离，切胶回收获得T载体，将微藻启动子片段连入Eam1105I酶切位点；微藻启动子连入后可得到完整的表达盒，由启动子、表达基因和终止子所组成。一种可克隆微藻启动子的T载体在检测微藻启动子功能中的应用，该方法简单，技术成熟可靠。利用该载体快速克隆微藻启动子，并在莱茵衣藻中进行启动子功能的验证，成为微藻基因工程研究人员的有利工具。

主权项

一种可克隆微藻启动子的前T载体的制备方法，其步骤是：A、可克隆微藻启动子的前T载体的构建：(1)以pBle1：5′‑GTAGATATCATGGCCAGGTG‑3′，pBle2：5′‑GCGGGTACCTTAATTAAGCTTC‑3′)为引物，通过PCR从质粒pSP124中扩增出大小为970bp的ble‑RBCS2终止子：94℃3min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，25个循环，72℃10min，克隆进pMD 18‑T载体中，获得T‑p124质粒，并经测序确认，通过EcoRⅤ和Kpn Ⅰ限制性内切酶双酶切质粒T‑p124获得ble‑3′RBCS2终止子，将它插入pSP124载体的EcoRⅤ和Kpn Ⅰ酶识别位点，获得pB124载体；(2)pB载体的构建：通过Eam1105Ⅰ限制性内切酶单酶切pB124载体，获得线性载体，再经T4DNA Polymerase使载体末端平滑化，突变原有的Eam1105Ⅰ酶识别位点，通过T4连接酶连接载体，获得pB载体；(3)pRB载体的构建：通过Eam1105Ⅰ单酶切pSP124载体(含RBCS2启动子‑ble‑RBCS2终止子)，获得线性载体，再经T4DNA Polymerase使载体末端平滑化，突变原有的Eam1105Ⅰ酶识别位点，通过T4连接酶连接载体，获得pRB载体；(4)间隔序列的获得：以pB‑bkt9：5′‑TTGGATCCGACTTTACGTCCAGTTCCGTGACATTGA‑3′，pB‑bkt10：5′‑CAAGATATCGACGCTTCGTCTCGTCTAGCTGTGCTATG‑3′为引物，通过PCR从质粒091127‑a3中扩增出大小为450bp的产物，获得引入两个Eam1105Ⅰ酶识别位点、一个EcoRⅤ和BamH Ⅰ酶识别位点的启动子，作为前T载体的间隔序列并命名为5′bkt1‑0.45；(5)pB‑0.45T载体的构建：通过EcoRⅤ和BamH Ⅰ限制性内切酶双酶切5′bkt1‑0.45，将其插入pB载体的EcoRⅤ和BamH Ⅰ酶识别位点，获得pB‑0.45T载体；(6)pRB‑0.45T载体的构建：通过EcoRⅤ和BamH Ⅰ限制性内切酶双酶切5′bkt1‑0.45，将其插入pRB载体的EcoRⅤ和BamH Ⅰ酶识别位点，最后获得pRB‑0.45T载体；B、启动子序列的T克隆：(1)T载体的制备：pB‑0.45T载体和pRB‑0.45T载体经Eam1105I限制性内切酶双酶切，37℃1小时，酶切产物经1％质量体积比琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收大片段即为T载体，经一般的商业回收试剂盒纯化后直接应用于PCR片段的T克隆；(2)启动子的PCR扩增：PCR扩增后能在产物末端加腺嘌呤脱氧核苷酸(A)的PCR酶，常见的有Taq DNA扩增酶和长链DNA扩增酶，采用Pfu高保真酶扩增，在PCR产物上通过Taq扩增酶加腺嘌呤脱氧核苷酸才能用T载体；(3)PCR片段的连接、转化：T载体和PCR产物按1∶1或1∶3摩尔比混匀，加入T4连接酶连接，转化到感受态大肠杆菌XL1细胞中，经氨苄抗生素筛选获得克隆了启动子PCR片段的重组子，经T3或T7引物测序确定插入片段的序列信息。