[发明专利]注射用重组人甲状旁腺素及其代谢产物血药浓度的测定方法

摘要

注射用重组人甲状旁腺素rhPTH(1-84)及其代谢产物rhPTH(1-34)血药浓度的测定方法，属PTH血浆浓度测定技术领域。本发明用固相萃取结合放射免疫分析(RIA)法，血浆样本采用固相萃取柱StyreScreen®H2P萃取，rhPTH(1-84)用甲状腺素放免试剂盒ELSA-PTH测定：取rhPTH(1-84)标准品或处理后的血浆样品加入ELSATUBES，再加入125I-PTH，复管测试，γ-count测计数CPM；以CPM值为纵座标，rhPTH(1-84)浓度为横坐标作图，得回归方程Y=19.791X；rhPTH(1-34)用甲状腺素放免试剂盒RK-055-08(PTH1-34)测定；将双复管加样品加抗体；孵育；每管加入125I-PTH后，振荡混匀后孵育；加羊抗兔，正兔血清，孵育；γ-counter测计数B，按B0=TB-NSB，以B/B0为纵坐标，rhPTH(1-34)浓度对数为横坐标作图，得函数方程。本发明提高了RIA检测的重复性和稳定性，增加了测定数据的可靠性。

主权项

1.一种注射用重组人甲状旁腺素rhPTH(1-84)及其代谢产物rhPTH(1-34)血药浓度的测定方法，其特征在于：血浆样本采用固相萃取柱StyreScreen®H2P萃取，rhPTH(1-84)采用甲状腺素放免试剂盒ELSA-PTH测定：rhPTH(1-34)采用甲状腺素放免试剂盒RK-055-08(PTH1-34)测定；步骤为：（1）、标准溶液制备rhPTH(1-84)标准溶液的制备取rhPTH(1-84)标准品，用去离子水溶解振荡，配制浓度分别为0、24、55、177、520pg·mL^-1标准品溶液；内质控PC配制成rhPTH(1-84)浓度为46pg·mL^-1的溶液；外质控QC配制含rhPTH(1-84)标准品浓度为25、250、500pg·mL^-1三种标准溶液，分装于离心管中，-80℃保存待用；rhPTH(1-34)标准溶液的制备取rhPTH(1-34)标准品用缓冲液稀释成10,20,40,80,160,320,640,1280pg·mL^-1的标准溶液；QC质控样品：精密称取rhPTH(1-34)标准，用缓冲液配制含rhPTH(1-34)浓度分别为40.00、160.00、640.00pg·mL^-1；所述缓冲液为甲状腺素放免试剂盒RK-055-08(PTH1-34)所提供的缓冲液；（2）、血浆样品处理将固相萃取柱StyreScreen®H2P依次用1mL乙醇、1mL含0.1%三氟乙酸去离子水活化；吸取0.5mL血浆样本，以1~2mL/min的速度加入固相萃取柱，样品富集后用1mL去离子水淋洗，抽干；用V/V为60:40的乙醇-0.1%三氟乙酸去离子水溶液洗脱，抽干；使用真空离心蒸发浓缩器干燥15min，去掉有机溶剂；经冷冻干燥器浓缩干燥，测定时用缓冲液稀释到合适的浓度；（3）、操作流程rhPTH(1-84)测定操作流程：取200μLrhPTH(1-84)标准品或处理后的血浆样品加入ELSATUBES，分别加入100μL¹²⁵I-PTH振荡3分钟，复管测试，25℃孵育18±2h，弃上清，加3mL吐温20，5分钟后弃上清，重复洗涤4次，γ-count测计数CPM；所述ELSATUBES为甲状腺素放免试剂盒ELSA-PTH提供的固相包被好的ELSA试管；rhPTH(1-34)测定操作流程：将聚苯乙烯管编号：总管TC，非特异性结合NSB，总结合TB，标准A～H，阳性对照PC，样品S，双复管加样品加抗体；振荡混匀后，封口4℃孵育16～24h；每管加入100μL¹²⁵I-PTH后，振荡混匀后4℃孵育16～24h；加羊抗兔IgG即GAR，正兔血清NRS，振荡室温孵育90分钟；除TC管外每管加500μL缓冲液振荡混匀，4℃3000rpm离心20分钟，在15～30分钟内吸弃上清，残余物γ-counter测量得B_X，并计算B=B_X-NSB；（4）、计算方法rhPTH(1-84)浓度计算：用CPM对rhPTH(1-84)浓度作图，以CPM值为纵座标，rhPTH(1-84)浓度为横坐标作图，得回归方程Y=19.791X，从方程中求得血浆样品中rhPTH(1-84)浓度，用DAS2.0软件计算药代动力学参数；rhPTH(1-34)浓度计算：γ-counter测得计数按B₀=TB-NSB，B/B₀(%)=(B_X-NSB)/B₀×100%计算，以B/B₀为纵坐标，rhPTH(1-34)浓度对数为横坐标作图，曲线拟合得函数方程，从方程中求得血浆样品中rhPTH(1-34)浓度，用DAS2.0软件计算药代动力学参数。