[发明专利]一种微RNA功能的双荧光报告系统的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种检测微RNA功能的双荧光报告系统的制备方法及应用，其制备步骤：A、PCR扩增获得mCherry基因序列，插入pEGFP-C1载体替代其EGFP序列，构建成载体pmCherry-C1；B、以RNAi-ReadypSIREN-RetroQ质粒为模板，PCR扩增获得人U6启动子基因，插入载体pmCherry-C1，获得质粒phU6-mCherry-C1；C、PCR扩增获得pAdtrack-CMV质粒上358-1944区间的基因序列，其中带有CMV启动子和EGFP表达框序列，将该序列插入质粒phU6-mCherry-C1中，获得质粒pMGhU6。该pMGhU6质粒即为同时含有mCherry报告基因、内参照EGFP、及微RNA和其靶标序列插入位点的双荧光报告系统。该报告系统可用于微RNA对其靶标序列表达抑制功能检测。检测方法易行，操作简便，只需转染一个质粒既可实现微RNA的功能检测。借助荧光显微成像，该系统还可以用于可视化检测单个活细胞内微RNA对其靶标的抑制功能。

主权项

一种微RNA功能的双荧光报告系统的制备方法，其步骤是：A、自质粒pRSET‑B‑mCherry上通过PCR扩增获得mCherry基因序列，利用双酶切位点Nhe I和Bgl II，把mCherry基因插入pEGFP‑C1载体上，替代pEGFP‑C1上的EGFP序列，构建成载体pmCherry‑C1；B、以RNAi‑Ready pSIREN‑RetroQ质粒为模板，PCR扩增获得U6启动子片段，PCR使用的上游引物：5’‑CAACATACGCGTTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCC‑3’(Mlu I)，下游引物：5’‑ATGGATACGCGTGCGGCCGCGACTGATATCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGAT‑3’，PCR扩增条件为：94℃5min，一个循环；94℃45s，60℃50s，72℃30s，进行30个循环；最后72℃延伸5min，扩增的产物经1％∶1克琼脂糖/100毫升水琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下目的条带，后用胶回收试剂盒进行回收，取2微克的回收产物及载体pmCherry‑C1用Mlu I酶切3小时，用PCR产物纯化试剂盒回收，将Mlu I消化后的pmCherry‑C1片段进行去磷酸化处理，37℃1h反应，65℃10min灭活磷酸化酶处理后，将反应产物用PCR产物纯化试剂盒回收，将回收后的酶切PCR产物和经酶切、去磷酸化处理的pmCherry‑C1片段以至少摩尔比3∶1比例混合，用T4DNA连接酶16℃过夜连接后转化E.coli GS500，挑取克隆，提质粒，酶切测序验证，获得phU6‑mCherry‑C1；C、将pAdtrack‑CMV质粒用Pac I酶切，胶回收试剂盒回收大片段后，再将回收产物用EcoR V酶切，胶回收试剂盒回收小片段，以上述回收产物为模板扩增带有CMV promoter、EGFP ORF及poly A尾的EGFP表达框序列：pAdtrack‑CMV  上358‑1944位置，使用上游引物：5’‑TACACAATCCACTACGTGCGCGTTAAGATACATTGATGAG‑3’，下游引物：5’‑TACACAAACCACGTAGTGTAATAGTAATCAATTACGGGGTC‑3’，PCR扩增条件为94℃5min，一个循环；94℃45s，60℃50s，72℃2min，进行30个循环；最后72℃延伸10min，扩增的产物经1％∶1克琼脂糖/100毫升水琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下目的条带，后用胶回收试剂盒进行回收，取2微克的回收产物及载体phU6‑mCherry‑C1用Dra III酶切3小时后用PCR产物纯化试剂盒回收，将Dra III消化后的phU6‑mCherry‑C1片段进行去磷酸化处理，将反应产物用PCR产物纯化试剂盒回收，将回收后的酶切PCR产物和经酶切、去磷酸化处理的phU6‑mCherry‑C1片段以至少摩尔比3∶1比例混合，用T4DNA连接酶16℃过夜连接后转化E.coliGS500，挑取克隆，提质粒，酶切测序验证，获得质粒pMGhU6。