[发明专利]液相芯片检测空肠弯曲菌的方法

摘要

一种液相芯片检测空肠弯曲菌的方法，属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术，提供一种用于检测空肠弯曲菌的方法，以便实现对空肠弯曲菌的快速检测。本发明制备了液相芯片，然后应用液相芯片检测空肠弯曲菌。本发明应用液相芯片检测空肠弯曲菌与其它几种检测方法相比，优势在于检测样品数量和检测项目的双向高通量（可同时对大量样品进行多达96个项目的检测）且具有灵活性好、灵敏度高、信噪比好、操作简便、标准曲线范围宽和应用范围广等特点，液相芯片技术作为生物信息学先进的操作平台，在临床诊断、兽医传染病诊断、食品微生物检测等领域具有广阔的应用前景。实现对空肠弯曲菌的快速检测，为食品安全做出贡献。

主权项

一种液相芯片检测空肠弯曲菌的方法，其特征在于：由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素‑藻红蛋白组成，所述微球为羧基化的35号微球；所述捕获抗体是空肠弯曲菌单克隆抗体，所述检测抗体是空肠弯曲菌的多克隆抗体，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与空肠弯曲菌结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合空肠弯曲菌的数量；液相芯片的制备：捕获抗体与微球偶联形成偶联体取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布，用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；液相芯片检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球，加入108 CFU/ml 的空肠弯曲菌10ul，用PBS‑TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200ul PBS‑TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10ul，用PBS‑TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS‑TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul，用PBS‑TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS‑TBN洗两次，再加入SA‑PE，用PBS‑TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS‑TBN洗涤两次，重悬于100ul PBS‑TBN中，上机进行检测。