[发明专利]鹅原代肝细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种鹅原代肝细胞的分离培养方法，涉及生物技术领域。操作步骤：鹅肝脏洗干净；肝灌流；用酶灌流液反复灌流，直至肝被膜下组织呈龟背状裂隙；肝脏剪碎；将剪碎的肝组织和胶原酶液水浴继续消化；加入胎牛血清的DMEM培养基终止其消化；过滤，获得肝细胞悬液；离心肝细胞悬液，在沉淀中加入PBS，再次制成肝细胞悬液；往肝细胞悬液中加入含胎牛血清的DMEM培养基，并把细胞吹打均匀；对细胞进行计数后，用DMEM培养液稀释，接种到细胞培养皿中，培养，使之贴壁；肝细胞培养后，用PBS清洗，获得活的原代肝细胞；加入胎牛血清的DMEM培养基培养。本发明解决了目前尚未有完善的鹅原代肝细胞分离培养方法的问题。

主权项

鹅原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，其操作步骤是：(1)将禁食11～13h的鹅腹腔注射戊巴比妥钠，注射量是28～31mg/kg体重和肝素钠95～105IU/kg体重，待其麻醉，仰卧位固定，腹部被皮消毒；(2)沿鹅腹部正中线切开腹腔，快速取出完整的肝脏，用38～40℃生理盐水把肝脏表面洗干净；(3)洗净的肝用38～40℃前灌流液灌流直至肝变为淡黄色；(4)再换成38～40℃清洗液冲洗出肝中前灌流液；(5)然后再用温度为38～40℃的0.04～0.06％酶灌流液反复灌流，直至肝被膜下组织呈龟背状裂隙；(6)把肝脏放入一玻璃培养皿中，撕开被膜，将肝脏剪碎；(7)将剪碎的肝组织和胶原酶液一起倒入一无菌锥形瓶中，38～40℃水浴继续消化5～10min左右；(8)加入含9～12％胎牛血清的DMEM培养基终止其消化；(9)然后用200目无菌纱网进行过滤，除去大的细胞团，获得肝细胞悬液；(10)以900～1000r/min，38～40℃离心肝细胞悬液1.8～2.2min，弃上清，在沉淀中加入PBS，再次制成肝细胞悬液；重复步骤(10)三次，直至肝细胞悬液清亮；(11)然后往肝细胞悬液中加入含9～12％胎牛血清的DMEM培养基，并把细胞吹打均匀；(12)用血细胞计数板对细胞进行计数后，用DMEM培养液稀释到3～5×105个cell/ml的密度，接种到细胞培养皿中，于4～6％CO2、38～40℃培养箱中培养，使之贴壁；(13)肝细胞培养2.8～3.2h后，用PBS清洗2～4次，以去掉未贴壁的血细胞和细胞碎片，获得活的原代肝细胞；(14)然后，加入9～12％胎牛血清的DMEM培养基，于4～6％CO2、38～40℃培养箱中培养。