[发明专利]一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法

摘要

一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法，用限制性内切酶xhoⅠ和限制性内切酶XbaⅠ分别对抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因和酵母表达载体pPICZ-α-A进行双酶切，将酶切后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因与酵母表达载体pPICZ-α-A进行连接，将连接后的产物转入大肠杆菌JM109内，形成重组质粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH，利用限制性酶切酶SacⅠ将重组质粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH线性化，将线性化的重组质粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH转入巴斯德毕赤酵母X-33菌内，形成阳性重组子，后对阳性酵母重组子进行诱导表达，得到表达后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH；本发明方法所制备出的表达后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH通过热稳定性能检测、pH性能值检测和苹果果汁抑菌活性，表明制备的食品防腐剂抗菌肽具有抗菌作用且抗菌效果明显，制备方法简单，能够广泛的应用于市场，提高了生产成本，提高经济效益。

主权项

1.一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法，其特征在于：步骤一、抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因的设计与合成：1）根据全球公共序列数据库Genebank中记载序列号为P80409的抗菌肽Metnikowin-Ⅱ的核苷酸序列为模板，在抗菌肽Metnikowin-Ⅱ的核苷酸序列后端加入6个组氨酸，即加入6个cat的核苷酸序列，形成抗菌肽Metnikowin-ⅡH，以抗菌肽Metnikowin-ⅡH的核苷酸序列为模板，依据毕赤酵母的偏嗜性，分别在抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因的前端加入限制性内切酶xho的酶切位点，后端加入限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，并在限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点前端加入终止密码子UAA，将设计好的核苷酸序列进行合成；其中抗菌肽Metnikowin-ⅡH的核苷酸序列为：GTTGATAAACCAGATCTTAGACCAAGACCATGGCCAAGACCAAATcatcatcatcatcatcat将抗菌肽Metnikowin-ⅡH的核苷酸翻译为氨基酸，抗菌肽Metnikowin-ⅡH的氨基酸序列为：VDKPDLRPRPWPRPNHHHHHH步骤二、抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因的酶切、回收：1）酶切体系的配制：在0.5ml离心管a中加入8.0μl抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因、0.5μl限制性内切酶XhoⅠ、0.5μl限制性内切酶XbaI、2.0μl限制性内切酶缓冲液和9.0μl去离子水，混合均匀，形成混合物A，将混合物A放入37oC水浴锅中，反应3小时，取出，备用；2）利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测：利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物A，在凝胶成像系统中确认混合物A中含有酶切后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因的目的基因；3）用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因进行回收、纯化：取1.5ml离心管a并称其重量，在紫外灯下将混合物A从步骤2）中的凝胶上切下，将切下的混合物A放在已称重的1.5ml离心管a中，称取1.5ml离心管a的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，将1.5ml离心管a中的混合物A捣碎，按每g混合物A加入1mlDNA纯化结合液的比例加入DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5ml离心管a放置在50oC水浴中加热至混合物A完全融解，得到混合液A，将混合液A加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a内，将收集管a置于21℃条件下放置1分钟，后将收集管a放到离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a内的液体，向DNA纯化柱a上加入700μl洗涤液，将DNA纯化柱a置于收集管a内，将收集管a在21℃条件下放置1分钟，后将收集管a送入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a内的液体，向DNA纯化柱a上加入500μl洗涤液，将DNA纯化柱a置于收集管a内，后将收集管a放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a中的液体后，将DNA纯化柱a置于收集管a内，再将收集管a放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a将其放置于1.5ml离心管b中，后在DNA纯化柱a上加入30μl洗脱液，使1.5ml离心管b在21℃条件下放置1分钟，后放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a得到1.5ml离心管中b中的液体，该液体就是酶切、回收并纯化后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因，存储于-20℃条件下，备用；步骤三、酵母表达载体pPICZ-α-A酶切、回收：1）酶切体系的配制：在0.5ml离心管b中加入8.0μl酵母表达载体pPICZ-α-A、0.5μl限制性内切酶XhoⅠ、0.5μl限制性内切酶XbaI、2.0μl限制性内切酶缓冲液和9.0μl去离子水，混合均匀，形成混合物B，将混合物B放入37oC水浴锅中，反应3小时，取出，备用；2）利用琼脂糖凝胶电泳对混合物B进行检测：利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物B，在凝胶成像系统中确认混合物B中含有酶切后的酵母表达载体pPICZ-α-A；3）用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的酵母表达载体pPICZ-α-A进行回收、纯化：依据步骤二中对混合物B即酶切后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因进行回收与纯化的方法对酶切后的酵母表达载体pPICZ-α-A进行回收与纯化，将回收、纯化后的酶切酵母表达载体pPICZ-α-A，存储于-20℃条件下，备用；步骤四、抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因和酵母表达载体pPICZ-α-A的连接：连接体系的配制：在0.5ml离心管c中加入2.0μl酶切酵母表达载体pPICZ-α-A、6.0μl酶切抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因、1.0μl的T4DNA连接酶和1.0μl10倍T4DNA连接酶缓冲液，混合均匀，后将0.5ml离心管c放在4oC条件下，放置12小时，形成混合物C，备用；步骤五、大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化：大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化均在无菌条件下操作，大肠杆菌JM109感受态细胞的制备：1）在10ml离心管a中加入5mlLB液体培养基和一个大肠杆菌JM109单菌落，混合均匀，转速为200转/分钟，37℃条件下，培养12小时，形成混合菌液Ⅰ，备用；2）在150ml三角瓶中加入1ml混合菌液Ⅰ和100mlLB液体培养基，混合均匀，形成混合菌液Ⅱ，转速为200转/分钟，37℃条件下进行培养，待混合菌液Ⅱ的OD600=0.4时停止培养，后将含有混合菌液Ⅱ的150ml三角瓶置于0℃冰水混合物中，放置10分钟，备用；3）在1.5ml离心管c中加入步骤2）中放置后的混合菌液Ⅱ1ml，将1.5ml离心管c送入4℃离心机内，转速为4000转/分钟，离心5分钟，弃去1.5ml离心管c内沉淀上层的液体，后在1.5ml离心管c内加入500μl的4℃CaCl₂溶液，浓度为0.1mol/L，混合均匀，后将1.5ml离心管c置于0℃冰水混合物中，放置30分钟，然后1.5ml离心管c送入4℃离心机内，转速为4000转/分钟，离心1分钟，弃去1.5ml离心管c内沉淀上层的液体，再加入200μl的4℃CaCl₂溶液，浓度为0.1mol/L，混合均匀，置于4℃条件下，放置12小时，形成大肠杆菌JM109感受态细胞，备用；大肠杆菌JM109感受态细胞的转化：1）在1.5ml离心管d中加入200μl大肠杆菌JM109感受态细胞和10μl步骤四中的混合物C，混合均匀，将1.5ml离心管d置于0℃冰水混合物中，放置30分钟，后取出将1.5ml离心管d置于42℃的水浴锅内，放置90秒，取出，再将1.5ml离心管d置于0℃冰水混合物中，放置5分钟后，取出，备用；2）在步骤1）的1.5ml离心管d内加入800μlLB液体培养基，混合均匀，送入37℃摇床内，转速为150转/分钟，离心45分钟，后送入离心机内，转速为300转/分钟，离心30秒，弃去1.5ml离心管d内沉淀上层的液体，得到沉淀物Ⅰ，备用；3）取200μl步骤2）中的沉淀物Ⅰ，并涂布于含有浓度为50μg/ml博来霉素的LB固体培养基上，放置20分钟，后置于37℃条件下，培养16小时，形成培养菌落，备用；步骤六、重组质粒的筛选和酶切鉴定：1）在50ml离心管a中加入45ml含有浓度为50μg/ml博来霉素的LB液体培养基和步骤五中的一个培养菌落，混合均匀，在37℃条件下，培养12小时，后将50ml离心管a送入离心机内，转速为300转/分钟，离心3秒，弃去50ml离心管a内沉淀上层的液体，得到沉淀物Ⅱ，备用；2）在0.5ml离心管d中加入5.0ug沉淀物Ⅱ、0.5μl限制性酶切酶BglⅡ、2.0μl的10倍限制性酶切酶BglⅡ缓冲液和12.5μl去离子水，混合均匀，形成混合物D，后将0.5ml离心管d送入37℃水浴锅内，放置3小时，备用；3）利用琼脂糖凝胶电泳对混合物D进行检测：利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物D，在凝胶成像系统中确认混合物D中含有酶切后的重组质粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH；将酶切后的重组质粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH进行序列测定，测序完成后利用生物软件DNAstar进行碱基序列比对、同源性分析；步骤七、重组质粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH的线性化：1）在0.5ml离心管e中加入混合物D即酶切后的20ug重组质粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH、5μl限制性酶切酶SacⅠ、20μl的10倍限制性酶切酶SacⅠ缓冲液和175μl去离子水，混合均匀，形成混合物E，后将0.5ml离心管e置于37℃水浴锅内，放置4小时，备用；2）利用琼脂糖凝胶电泳对混合物E进行检测：利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物E，在凝胶成像系统中确认混合物E中含有线性化后的重组质粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH，其线性化后的目的片段为3600bp，备用；3）在1.5ml离心管e中加入190μl混合物E即线性化的重组质粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH、200μl去离子水和390μl苯酚，混合均匀，形成混合物F，后将1.5ml离心管e送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上层澄清液体Ⅰ，在1.5ml离心管f中加入200μl上层澄清液体Ⅰ和200μl酚与氯仿混合液，混合均匀，后将1.5ml离心管f送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上层澄清液体Ⅱ，在1.5ml离心管g中加入200μl上层澄清液体Ⅱ、20μl浓度为3mol且pH为5.2的NaAC和500μl的0℃无水乙醇，混合均匀，在-20℃条件下放置1小时，然后将1.5ml离心管g送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心10分钟，弃去1.5ml离心管g内沉淀上层的液体，在含有沉淀的1.5ml离心管g内加入500μl浓度为70%的乙醇，混合均匀，然后将1.5ml离心管g送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心10分钟，弃去1.5ml离心管g内沉淀上层的液体，后1.5ml离心管g内加入500μl浓度为70%的乙醇，混合均匀，后将1.5ml离心管g送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心10分钟，弃去1.5ml离心管g内沉淀上层的液体，得到沉淀物Ⅲ，在含有沉淀物Ⅲ的1.5ml离心管g中加入去离子水，形成浓度为1μg/μl的pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH溶液，备用；步骤八、酵母菌X-33感受态细胞的制备1）巴斯德毕赤酵母X-33菌的活化：在YPDS固体培养基中接种3μg巴斯德毕赤酵母X-33菌，将YPDS固体培养基置于30℃条件下培养72小时，观察到白色单个菌落，备用；2）在无菌条件下制备巴斯德毕赤酵母X-33菌感受态细胞：①在10ml离心管b中加入5ml的YPDS液体培养基和一个巴斯德毕赤酵母X-33菌的单菌落，混合均匀，形成混合菌液Ⅲ，30℃条件下培养12小时，备用；②在250ml三角瓶中加入0.5ml混合菌液Ⅲ和50mlYPDS液体培养基，混合均匀，形成混合菌液Ⅳ，30℃条件下进行培养，待混合菌液Ⅳ的OD600=1.5时停止培养，形成混合液B，在50ml离心管b中加入45ml混合液B，将50ml离心管b送入4℃离心机内，转速为2500转/分钟，离心5分钟，弃去50ml离心管b内沉淀上层的液体，后在50ml离心管b中加入45ml去离子水，混合均匀，将50ml离心管b送入4℃离心机内，转速为1500转/分钟，离心5分钟，得到沉淀，在含有沉淀的50ml离心管b内再次加入45ml去离子水，混合均匀，然后将50ml离心管b送入4℃离心机内，转速为1500转/分钟，离心5分钟，得到沉淀物Ⅴ，备用；③重复步骤②的方法一次，后在含有沉淀物Ⅴ的50ml离心管b中加入10ml浓度为1mol的0℃D-山梨醇，混合均匀，将50ml离心管b送入4℃离心机内，转速为1500转/分钟，离心5分钟，得到沉淀物Ⅵ，备用；④在含有沉淀物Ⅵ的50ml离心管b内加入浓度为1mol的D-山梨醇，得到OD600=1.0的巴斯德毕赤酵母X-33菌感受态细胞，备用；步骤九、阳性重组子的制备及筛选1）在4ml离心管中加入步骤七中10μl浓度为1μg/μl的pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH溶液和80μlOD600=1.0的巴斯德毕赤酵母X-33菌感受态细胞，混合均匀，形成混合液C，备用；2）在0oC条件下，将电击杯放于浓度为70%的乙醇中，浸泡30分钟后，取出，在电击杯内加入120μl混合液C，将电击杯放置5分钟，后将电击杯放到电转化仪内，进行电击，电脉冲为25微法，电压为1.5千伏，电阻为200欧姆，电击时间为0.05秒，电击结束后，取出含有混合液C的电击杯，后在电击杯内加入1mlD-山梨醇，混合均匀，得到混合物G，将混合物G加到1.5ml离心管h中，将1.5ml离心管h送入30oC摇床中，转速为225转/分钟，培养2小时后，取100μl培养后的混合物G，并将其涂布于含有浓度为100μg/ml博来霉素的YPDS固体培养基上，将涂布后的YPDS固体培养基置于30oC培养箱内，培养4天，得到白色单菌落，备用；4）将步骤3）中得到的全部白色单菌落接种到MM固体培养基上，然后将接种后的MM固体培养基置于30oC的培养箱内，培养3天，观察并得到巴斯德毕赤酵母Mut⁺菌落，备用；5）取步骤4）中的一个巴斯德毕赤酵母Mut⁺菌落，并将其接种到含有浓度为1000μg/ml博来霉素的YPDS固体培养基上，将涂布后的YPDS固体培养基置于30oC的培养箱内，培养3天，观察到单个菌落，即得到的阳性重组子，备用；步骤十、对阳性重组子进行检测1）在1.5ml离心管i中加入一个阳性重组子和100μl的pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均匀，形成混合液D，在1.5ml离心管j中加入100μl混合液D，混合均匀，将1.5ml离心管j送入离心机内，转速为2500转/分钟，离心5分钟，弃去1.5ml离心管j内沉淀上层的液体，在1.5ml离心管j内加入500μl的PBS溶液，混合均匀，将1.5ml离心管j送入离心机内，转速为2500转/分钟，离心5分钟，弃去1.5ml离心管j内沉淀上层的液体，在1.5ml离心管j内加入100μlpH为8.0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均匀，后将1.5ml离心管j置于100℃沸水中，加热10分钟，后将加热后的1.5ml离心管j置于-80℃条件下，放置30分钟，取出，再将1.5ml离心管j置于100℃沸水中，加热10分钟，取出，将1.5ml离心管j送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上层液体，即得到酵母基因组DNA，备用；2）利用通用鉴定引物5’AOX和3’AOX对步骤7）中的酵母基因组DNA进行PCR鉴定PCR反应液的配制：在0.5ml离心管f中加入2.5μl酵母基因组DNA、2.5μL10倍PCR缓冲液、1μl浓度为2.5mmol的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、1.5μl浓度为25mmolMg²⁺的PCR缓冲液、0.25μl的引物5’AOX、0.25μl的引物3’AOX、0.25μl的TaqDNA聚合酶和16.75μl去离子水，混合均匀，PCR反应液，备用；PCR程序：将PCR反应液放入PCR仪内，PCR扩增共30个循环，先94℃预变性5分钟，后94℃变性30秒、56℃退火30秒和72℃延伸45秒为一个循环，完成30个循环后，72℃再次延伸10分钟，形成PCR产物；利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶成像系统中确认PCR产物中含有酵母基因组DNA目的片段，表明抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因己整合到酵母菌基因组内，即得到含有抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因的酵母菌，备用；步骤十一、阳性酵母重组子的诱导表达1）取含有抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因的酵母菌，将其接种到5ml含有浓度为100μg/ml博来霉素的YPDS液体培养基上，混合均匀，形成培养菌液a，将培养菌液a置于30oC条件下培养12小时，在50ml离心管c中加入10mlBMGY液体培养基和0.2ml培养后的培养菌液a，混合均匀，形成培养菌液b，将培养菌液b置于30oC条件下，培养至培养菌液b的OD600=5时，将50ml离心管c送入离心机内，转速为1000转/分钟，离心3分钟，得到沉淀物Ⅶ，在50ml离心管d中加入30mlBMMY液体培养基和10ml沉淀物Ⅶ，混合均匀，形成培养菌液c，将培养菌液c置于28oC条件下培养96小时，在培养过程中每隔24小时添加2ml浓度为0.5%的甲醇，培养结束后，将50ml离心管d送入离心机内，转速为8000转/分钟，离心10分钟，得到上层澄清液体，即为表达后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH；所述的含有浓度为50μg/ml博来霉素的LB固体培养基的组成成份：按重量百分比培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的博来霉素、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1.5%的琼脂粉，余量为水；所述的含有浓度为50μg/ml博来霉素的LB液体培养基的组成成份：按重量百分比培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的博来霉素、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水；所述的LB固体培养基的组成成份：按重量百分比LB固体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1.5%的琼脂粉，余量为水；所述的LB液体培养基的组成成份：按重量百分比LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水；所述PBS溶液组成成份：按重量百分比PBS溶液中含有0.8%的氯化钠、0.024%的磷酸二氢钾、0.02%的氯化钾、0.144%的磷酸氢二钠，余量为水；所述三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液的组成成份：每升三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有10mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、1mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的DNA纯化结合液的组成成份：每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、10mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的洗涤液的组成成份：按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基磺酸钠，余量为水；所述的洗脱液的组成成份：按重量百分比洗脱液中含有40%的浓度10mol/L的乙酸钠、8.5%的冰醋酸，余量为水；所述的YPDS固体培养基的组成成份：按重量百分比YPDS固体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、2%的葡萄糖、2%的琼脂粉，余量为水；所述的YPDS液体培养基的组成成份：按重量百分比YPDS液体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、2%的葡萄糖，余量为水；所述的含有浓度为100μg/ml博来霉素的YPDS固体培养基的组成成份：按重量百分比培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博来霉素、2%的葡萄糖、2%的琼脂粉，余量为水；所述的含有浓度为1000μg/ml博来霉素的YPDS固体培养基的组成成份：按重量百分比培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、10%的博来霉素、2%的葡萄糖、2%的琼脂粉，余量为水；所述的含有浓度为100μg/ml博来霉素的YPDS液体培养基的组成成份：按重量百分比培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博来霉素、2%的葡萄糖，余量为水；所述的BMMY液体培养基的组成成份：按重量百分比BMMY液体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1.34%的无氨基酸酵母氮源、0.4%生物素、0.5%甲醇、1.0%的磷酸盐缓冲液，余量为水；所述的BMGY液体培养基的组成成份：按重量百分比BMGY液体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1.34%的无氨基酸酵母氮源、0.4%生物素、1%甘油、1.0%的磷酸盐缓冲液，余量为水；所述的MM固体培养基的组成成份：按重量百分比MM固体培养基中含有1.34%的无氨基酸酵母氮源、4x10^-5%生物素、0.5%甲醇、1.5%的琼脂粉，余量为水；所述的溶液Ⅱ的组成成份：按重量百分比溶液Ⅱ中含有0.06%浓度为10mmol/L的氢氧化钠、10%的十二烷基磺酸钠，余量为水；所述的溶液Ⅲ的组成成份：按重量百分比溶液Ⅲ中含有60%的浓度5mol/L的乙酸钾、11.5%的冰醋酸，余量为水；所述的酚与氯仿混合液的组成成分：按体积比酚与氯仿混合液中含有25份的酚和24份的氯仿。