[发明专利]一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法

摘要

本发明提供了一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法。其方法是以橡胶树未授粉胚珠为外植体，在诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转接到分化培养基上产生胚状体；胚经过成苗培养基诱导出完整植株。本发明工艺流程简单，生产成本低，培养出生长快、产量高、抗逆性强的体胚植株。利用未授粉胚珠来获得体胚植株，克服了花药组培雄蕊剥离困难、白粉病流行季节污染严重的缺点，丰富了橡胶树组培外植体的来源，为橡胶选育种及良种繁育提供了新材料，具有很大的应用价值。

主权项

一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法，包括外植体的选择处理过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚状体分化培养过程、植株再生的诱导过程，其特征在于：（1）外植体的选择处理过程：选取优良品种的雌花，花朵呈黄色、未开花前1‑2天时为材料，摘下的雌蕊用无菌纱布包好，在超净工作台上用75%的乙醇处理30秒，再用0.1%的升汞消毒10~20分钟，并用镊子不停地搅动，使之彻底灭菌，最后用无菌水冲洗5~6次；（2）胚性愈伤组织诱导过程：用摄子和解剖针剥取雌蕊，取出幼小胚珠接种于诱导胚性愈伤组织的培养基上，进行光照培养，培养温度为26~28℃之间，光照10h·d‑1，光照强度为500lx，培养20~60天后，会从外植体上诱导出新鲜、松散、黄色颗粒状的胚性愈伤组织；所述诱导胚性愈伤组织的培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1320~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.5~2.5 mg/L 、NAA0.5~3.0 mg/L、6‑BA0.5~3.0mg/L、2,4‑D1.0~3.0mg/L、半胱氨酸100~450 mg/L、PVP500~1500 mg/L、水解乳蛋白30~70 mg/L、葡萄糖200~600 mg/L、椰子水40~80 mg/L、蔗糖50~90g/L、琼脂4~7 g/L；（3）胚状体分化培养过程：将产生的胚性愈伤组织接种于胚状体分化培养基上，进行光照培养，培养温度为23~27℃之间，光照10h·d‑1，光照强度为500lx，培养20~60天后，胚性愈伤组织进一步分化胚状体，并将分化出的胚状体转入胚状体分化培养基中进行成熟培养，一个月更换一次新鲜培养基；所述胚状体分化培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1300~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.5~2.5 mg/L、NAA0.1~2 .0mg/L、GA30.1~1.5 mg/L、蔗糖60~90g/L、琼脂4~7 g/L；（4）植株再生的诱导过程：将分化出的成熟胚状体移入成苗培养基，进行光照培养，培养温度为26~29℃之间，光照10h·d‑1，光照强度为500lx，培养20天后，成熟胚状体长出主根和侧根，随后抽茎长叶，50天后发育成具有根、茎、叶的完整小植株；所述成苗培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1300~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.01~1.0 mg/L、IAA0.1~2.0 mg/L、GA30.1~1.5 mg/L、5‑溴尿嘧啶0.1~1.0 mg/L、蔗糖40~70g/L、琼脂4~7 g/L。