[发明专利]一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

摘要

本发明公开了一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，本发明的方法是将提取的hAECs经含10mmol/L尼克酰胺和N2补充物的无血清HG-DMEM诱导培养基培养7天，经本发明方法诱导的hAECs表达胰岛素基因mRNA和PDX-1基因mRNA，培养物上清中的胰岛素含量达330μIU/ml以上。本发明方法可在体外诱导hAECs分化为ISCs。

主权项

一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤： （1）分离hAECs：采用机械法剥离胎盘羊膜组织，用D‑Hank’s液反复冲洗，除尽表面血迹，剪碎羊膜后分装于离心管内，加入含有0.02%EDTA 的0.05%胰蛋白酶溶液，消化后弃消化液，再旋转消化，250目不锈钢网过滤，收集单细胞悬液，加含胎牛血清的培养基终止消化，组织碎片用同样方法重复消化2次，合并3次收集的细胞悬液经300目不锈钢网过滤，滤液离心弃上清，再悬浮细胞，离心弃上清，收获细胞即为人羊膜上皮细胞，用低糖‑DMEM培养基重新悬浮细胞，以3×108 L‑1细胞密度接种于T25培养瓶，置37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2培养箱中培养； （2）鉴定hAECs：取第2代hAECs波形蛋白和CK19免疫组织化学染色，用流式细胞仪检测CD29、CD73、CD166、CD34和CD45；（3）诱导hAECs向ISCs分化：诱导分化培养基为含10mmol/L尼克酰胺和N2补充物无血清高糖‑DMEM培养基；取第2代hAECs用诱导分化培养基悬浮，以2.5×106个/ml细胞密度接种于6孔培养板，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2培养箱中培养7天，第三天用诱导分化培养基换液1次；hAECs经上述诱导分化培养其诱导培养7天即分化为ISCs；（4）ISCs的鉴定：hAECs诱导培养7天后，①取培养物上清液，采用放射免疫法检测胰岛素含量；② 收集部分细胞，采用逆转录‑聚合酶链反应（PT‑PCR）检测胰岛素基因mRNA和调节胰腺发育及胰岛B细胞分化的关键性转录因子胰十二指肠同源异型盒因子‑1基因mRNA的表达。