[发明专利]一种鸡下丘脑神经元体外培养的方法

摘要

本发明涉及一种鸡下丘脑神经元体外培养方法，具体包括以下步骤：细胞培养板包被；基础培养液配制；样品采集；组织分散；细胞计数和接种以及细胞纯化。本发明的目的是建立一种简单易行、高纯度的鸡下丘脑神经元细胞体外培养的方法，为提高家禽食欲以及其他下丘脑生理研究提供鸡下丘脑神经元细胞。

主权项

一种鸡下丘脑神经元体外培养方法，其特征在于包括以下步骤：  1）细胞培养板包被配制浓度为0.01～0.25mg/L的多聚赖氨酸(Sigma)溶液包被细胞培养板，六孔板，每孔2ml，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育2小时以上，最好过夜；然后用DMEM洗一遍，再用双蒸水洗1～3遍，然后置于培养箱中，待完全干燥后备用；2）基础培养液配制      用DMEM、胎牛血清Gibco和马血清Gibco配制基础培养液，各组分的体积百分比为：DMEM80～94%、胎牛血清5～15％和马血清1～5％； 3）样品采集取鸡下丘脑组织，用DMEM冲洗3‑4次；4）组织分散    将冲洗后的鸡下丘脑组织剪碎至1mm3大小，加浓度为0.1～0.25％的胰蛋白酶Solarbio溶液适量，37℃水浴5～15min；每隔3min剧烈摇晃一下；待鸡下丘脑组织块消化到几乎消失时，加入与胰蛋白酶等体积的步骤2）配制的基础培养液终止消化，然后过200目网筛，吸取悬浊液装入离心管，离心5～15min，600～1500rpm；弃上清液，加DMEM重悬，然后再离心5～15min，600～1500rpm；    5）细胞计数将步骤4）离心后的悬浊液弃上清液，用步骤2）配制的基础培养液重悬，再用0.4％的台盼蓝染色计数，计算悬浊液中活细胞比例、细胞总数，以及可接板数；根据计数结果，在悬浊液中加入步骤2）配制的基础培养液，使悬浊液中细胞浓度达到5～20×105个/ml；    6）细胞接种六孔细胞培养板每孔接种上述悬浊液2ml，接种24h后全换液，以后一周换两次液，每次均为半换液；    7）细胞纯化      如果细胞培养48～72h时，观察到有杂细胞如神经元胶质细胞存在，每孔加入适宜浓度的阿糖胞苷Sigma，处理12～48h后，用步骤2）配制的基础培养液完全换液。