[发明专利]一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法

摘要

一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法，包括以下步骤：（1）交联法共固定化双酶；（2）鱼鳞预处理；（3）共固定化酶定向水解鱼鳞蛋白；（4）脱色脱腥；（5）鱼鳞多肽超滤分离；（6）真空浓缩；（7）冷冻干燥。本发明所制备的抗氧化活性肽可作为天然抗氧化剂用于食品抗氧化保鲜中，且无毒副作用，安全性高；所用方法酶解效率高，酶可以多次利用，酶解产物易于纯化；为淡水鱼废弃物的有效利用提供了一条新途径；产品可用于药品、食品和化妆品。

主权项

一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法，其特征是按以下步骤：（1）以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶中任意两种酶组成复合蛋白酶，按照活力比为1:1‑1:3将两种酶溶于磷酸盐缓冲液中配制成质量浓度为1.0‑5.0%蛋白酶溶液，取配制的蛋白酶溶液加入pH4‑10、质量浓度为2.0‑6.0%的海藻酸钠溶液中，蛋白酶溶液与海藻酸钠溶液体积比为1:1‑1:5；待充分搅拌均匀后，加入质量浓度为0.5‑5.0%的氯化钙溶液中，移入4℃冰箱硬化2‑6 h，过滤洗涤；然后加入体积分数为0.1‑3%戊二醛溶液中，振荡0.5 h，于4‑25℃静置交联4‑6 h，用磷酸盐缓冲液将残余戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷风吹干表面水分得共固定化双酶；（2）将新鲜鱼鳞浸泡洗净、烘干、粉碎、筛网、脱钙，脱除鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白；（3）控制温度为40‑60℃，pH在6‑10，按鱼鳞重量比1‑5%加入固定化双酶酶解，酶解时间为2‑6 h，期间不断搅拌并加入酸液或碱液使反应体系维持在初始值pH值，酶水解反应结束后升温至100℃，保持10 min灭活，快速冷却反应液，然后采用离心机转速5000 r/min，离心分离15‑20 min，得到上层的酶解液；（4）在酶解液中加入质量比为0.5‑3%食品级粉状活性炭，将水解液置于50℃的水浴锅内处理60 min，然后经5000 r/min离心获得上清液，即鱼鳞蛋白酶解液；（5）鱼鳞蛋白酶解液经10 kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液；将滤液再经3kDa超滤膜截流分离，保留浓缩液和滤液；超滤过程中组件最大工作压力不超过0.15 MPa，依次得到分子量为10 kDa以上、3‑10 kDa、3 kDa以下的鱼鳞多肽溶液；（6）真空浓缩；（7）冷冻干燥。