[发明专利]克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法

摘要

本发明公开了一种克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法，包括：1)构建pDK6-red质粒；2)pDK6-red质粒转化入克雷伯氏肺炎杆菌细胞；3)制备用于基因重组的DNA片段；4)制备含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞，培养过程中加入IPTG；5)将用于基因重组的DNA片段，通过电击转化进入制备好的感受态细胞；6)培养转化后的感受态细胞，通过抗性标记筛选重组菌株；本发明采用不同的抗性标记基因，获得多位点重组菌株；同时，还能对抗性标记进行消除，抗性消除菌株可重新作为出发菌株进行基因重组操作，从而实现对一株克雷伯氏肺炎杆菌进行多次基因重组操作，因此，能具有更广泛的应用。

主权项

一种克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法，其特征在于：包括步骤：1)克隆Red重组酶基因，连接于pDK6质粒的多克隆位点，命名为pDK6‑red质粒；2)将pDK6‑red质粒电击转化入克雷伯氏肺炎杆菌细胞中；3)制备用于第一位点基因重组的DNA片段，该片段的两端含有与第一目的重组序列两端同源的同源臂，同源臂内侧连接抗性标记I基因；4)制备含有pDK6‑red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞，培养过程中在培养基中加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷，诱导Red重组酶的表达；5)将用于第一位点基因重组的DNA片段，通过电击转化进入制备好的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞；6)将转化后的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞进行培养，通过所述的抗性标记I，筛选得到重组菌株。