[发明专利]一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺

摘要

本发明涉及一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺，以林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)为出发菌株，经60Goγ射线诱变及原生质体紫外诱变后，采用特定的培养基，经液态深层发酵生产蛋白酶K。在培养温度为22～28℃，发酵液pH值维持在5.5～6.0范围内，发酵罐搅拌转速为250～500rev/min的培养条件下，蛋白酶K的产量有大幅度提高，适用于工业化生产。与现有技术相比，本发明填补了国内在蛋白酶K生产工艺上的空白，大幅度提高了生物表达量，同时降低了生产成本，从而极大地提高了产品的市场竞争力。

主权项

一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤：(1)以林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)为出发菌株，经过60Goγ射线诱变和原生质体紫外诱变选育；(2)以经过改良的燕麦培养基为种子培养基，将斜面菌种接种至一级种子培养液中，摇瓶发酵培养40～44h后以7～10％的接种量接种至二级种子培养基中；(3)二级种子培养液在通风搅拌式发酵罐中培养40～44h后以7～10％的接种量接种于特定的发酵培养基；(4)继续在通风搅拌式发酵罐中进行发酵培养，于48～72h后结束发酵并收集发酵液；(5)将发酵液转移至提取储罐中，过滤除菌体并收集滤出液；(6)往滤出液中添加25％饱和度的硫酸铵进行沉淀，该过程要不断搅拌，待硫酸铵全部加完后，测定混悬液的pH值，并用0.1N的HCl溶液调节pH值至5.0，4℃离心并收集上清液；(7)往上清液中继续添加硫酸铵至饱和度为60％，4℃离心得沉淀；(8)将沉淀溶于层析缓冲液中，不断搅拌使沉淀全部溶解，过滤清液；(9)以市售的CM‑Sepharose Fast Flow凝胶为离子交换层析介质，进一步分离纯化蛋白酶K，将层析介质装柱后，用层析缓冲液进行平衡，平衡后将沉淀溶解过滤清液上样，流速控制在线速度25‑50cm/hr，上样完毕，用上述缓冲液冲柱，冲至流出液的OD280nm小于0.1，换用洗脱液洗脱，流速控制在线速度25‑50cm/hr，收集洗脱峰；(10)采用超滤膜系统对洗脱峰进行浓缩脱盐，将浓缩脱盐液用0.22um滤膜过滤除菌；(11)采用冷冻干燥技术，将过滤除菌液直接冷冻干燥，得到固体白色粉状成品蛋白酶K。