[发明专利]一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法

摘要

本发明公开了一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法，包括以下步骤：A1，基因组DNA提取；A2，SSR分析；A3，杂种鉴定。利用EST序列设计引物，利用开发得到的多态性高，带型稳定且清晰的具有双亲互补型条带的SSR引物对柳枝稷杂交种的植株或种子DNA进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，具有父本特异性条带的杂交种即为真杂交种。本方法操作简便，费用低，准确度高且通用性好，可以用于快速鉴定柳枝稷不同亲本组合的杂交种真实性。

主权项

一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1，基因组DNA提取：以待鉴定的柳枝稷植株幼叶或种子为材料，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA；提取的DNA用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行纯度的检测；将DNA样品置于‑20℃冰箱保存；待开始实验时，将各个DNA样品取出一部分稀释至20ng/μL，放于4℃冰箱保存并使用；A2，SSR分析：利用筛选得到的可以用于柳枝稷杂种鉴定EST‑SSR标记引物：primer1‑F：5’‑AGTTTGAGCTTTGTGTTTTTG‑3’，primer1‑R：5’‑CAACAATTTGGTTTCAACAAG‑3’；进行杂种鉴定；PCR反应扩增体系20μL：DNA 2μL(20ng/μL)，2×Taq PCRMasterMix 10μL，上下游引物各1μL(10μmol/L)，灭菌水补齐20μL；EST‑SSR PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。电泳分离：最后PCR扩增产物采用1.8％的MetaPhor琼脂糖凝胶进行电泳分离，0.1mg/mL的溴化乙锭染色，120V电压在0.5×TBE缓冲液中电泳约1.5h，电泳结束后凝胶在凝胶成像系统中照相并保存；或者用PCR扩增产物在6％的聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉＝19∶1，7.5mol/L尿素，1×TBE缓冲液)上用1×TBE缓冲液进行垂直电泳分离。首先在正极缓冲液中加入EB(终浓度：0.75μg/ml)，用300伏电压跑45分钟，然后点样，300伏电压跑2小时。电泳结束后凝胶在凝胶成像系统(Bio‑rad)中照相并保存。A3，杂种鉴定：在杂交后代的扩增产物中，若具有父本特异条带，则为真杂种，反之，则为假杂交种。