[发明专利]藏獒源犬细小病毒的分离鉴定方法

摘要

本发明公开了一种藏獒源犬细小病毒的分离鉴定方法，包括以下步骤：A1、病料采集与处理；A2、病毒分离；A3、PCR鉴定；本发明尝试了用直肠棉签拭子法采样，既能保证样品的新鲜度、减少污染，又能及时采到样品、节约采样时间。

主权项

一种藏獒源犬细小病毒的分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、病料采集与处理：临床上经CPV胶体金试纸检测为阳性的藏獒，将灭菌棉签伸入发病藏獒肛门，擦拭直肠壁，沾取肠黏膜上皮，将棉签头置于1.5ml EP管，加入无血清的DMEM至1ml；反复冻融3次，每次化冻后在振荡器上振荡1‑2min后再进行下一次冻融；冻融后将液体转入15ml离心管中，用无血清DMEM反复冲洗、振荡棉签头3‑4次，并将冲洗后的液体也转入离心管中，最后加无血清DMEM至10ml，制成10％混悬液；8000rpm离心10‑15min；取上清液，0.22um微孔滤膜过滤后，置于‑20℃备用；A2、病毒分离：10％混悬液按1∶30‑1∶60同步接毒F81细胞，加入含15％FBS的DMEM后，置于37℃、5％CO2中2‑4h，换液，PBS荡洗细胞1‑2次，加15％DMEM，继续培养24h；每天观察细胞，配制含FBS 15％和5％的DMEM，根据细胞生长情况及时改变FBS的浓度；长满一层后仍不出现CPE，按常规方法传代，如传至第5代仍无CPE，则视为病毒分离阴性；细胞若出现大面积CPE时收细胞和上层培养液，反复冻融3次，10000rpm，离心10‑15min；取出上清，调节PH值到7.2‑7.5，加入乙二醇至最终浓度为8％(w/v)；置于4℃中2h后，11000rpm，浓缩2h，加入少量无血清DMEM溶解病毒团块，置于‑20℃中备用；A3、PCR鉴定；根据GenBank上公布的CPV的VP2核酸序列分别设计扩增VP2片段的特异性引物一对：P1、P2；扩增VP2全基因的特异性引物一对：P3、P4；扩增的目的片段大小分别为825bp和1755bp；由上海Invitrogen公司合成，引物序列为：上游引物P1：5’‑AACGGATGGGTGGAAATCAC‑3’下游引物P2：5’‑TAATAGTAGCTTCAGTAATA‑3’上游引物P3：5’‑CCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC‑3’下游引物P4：5’‑AATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGA‑3’。