[发明专利]带有荧光素酶标签的EV71型全长感染性克隆的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种带有荧光素酶标签的EV71全长感染性克隆的制备方法及应用，属于生物技术领域。其步骤是：（1）总RNA的提取；（2）EV71的RT-PCR扩增；（3）EV71亚克隆的构建；（4）含有EV71基因的重组克隆的构建（5）带有Rluc标签的EV71全长感染性克隆的构建。通过细胞病变、Rluc活性的检测、病毒蚀斑和药物抑制等实验证明成功获得带有标签的EV71全长感染性克隆。本发明在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选和药物作用机制、疫苗和诊断试剂的研发等方面具有广泛的应用价值。

主权项

一种带有荧光素酶标签的EV71型全长感染性克隆的制备方法，其步骤是：(1)总RNA的提取：取140ul的EV71病毒液，按照QIAamp Viral RNA试剂盒说明书的要求抽提EV71的RNA；(2)EV71的RT‑PCR扩增：根据EV71基因的特性，将该基因分为了四个部分，分别命名为F1、F2、F3和F4，以步骤(1)中的总RNA为模版，采用RT‑PCR分别获得DNA片段F1、F2、F3和F4，片段的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示，DNA片段F1的引物：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，DNA片段F2的引物：SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，DNA片段F3的引物：SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10，DNA片段F4的引物：SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。另外SEQ ID NO：5含有T7RNA聚合酶启动子序列SEQ ID NO：13；RT‑PCR的反应体系均为：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix：2μl，2×1StepBuffer：25μl，引物：1μl，引物：1μl，模板RNA为：3μl，无RNase水：18μl；扩增条件为：50℃30min，94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环；(3)EV71亚克隆的构建：将步骤(2)中获得的片段F1、F2、F3、F4分别和载体pUC19连接，并将连接产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pUC19‑F1、pUC19‑F2、pUC19‑F3和pUC19‑F4；(4)含有EV71基因的重组克隆的构建：用BsiwI和HindIII酶切步骤(3)中获得的pUC19‑F1和pUC19‑F2，回收pUC19‑F1的大片段和pUC19‑F2的小片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pUC19‑F1‑F2；用SpeI和HindIII酶切步骤(3)中获得的pUC19‑F3和pUC19‑F4，回收 pUC19‑F3的大片段和pUC19‑F4的小片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pUC19‑F3‑F4；用AatII和HindIII酶切pUC19‑F1‑F2和pUC19‑F3‑F4，回收pUC19‑F1‑F2的大片段和pUC19‑F3‑F4的大片段的大片段，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pUC19‑F1‑F2‑F3‑F4；用XbaI和HindIII酶切pUC19‑F1‑F2‑F3‑F4和pACYC177，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的pUC19‑F1‑F2‑F3‑F4和经过酶切的pACYC177，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pACYC‑EV71‑FL；(5)带有Rluc标签的EV71全长感染性克隆的构建：为了获得Rluc基因片段，基因序列为SEQ ID NO：14所示，设计引物SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16扩增Rluc基因片段；将获得的Rluc基因片段和步骤(4)中的pACYC177‑EV71‑FL分别为用SphI和MluI酶切，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的Rluc基因片段和pACYC177‑EV71‑FL，使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的产DNA片段，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pACYC177‑EV71‑Rluc‑FL。