[发明专利]一种克隆山羊PID1基因编码区全序列的方法

摘要

本发明公开了一种克隆山羊PID1基因编码区全序列的方法，包括以下步骤：A1、提取山羊背最长肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；A2、引物的设计及PCR反应：以哺乳动物该基因的保守区作为模板在起始密码子上游和终止密码子的下游设计保守引物：上游引物P1：5′-CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3′下游引物P2：5′-TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3′。A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。提供一种简单、快捷的获取山羊PID1基因的完整编码区序列的方法，填补了该基因在山羊上的空白，为进一步研究山羊的该基因奠定了基础。

主权项

一种克隆山羊PID1基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、从健康的山羊腹肌组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；A2、引物的设计及PCR反应：以哺乳动物该基因的保守区作为模板在起始密码子上游和终止密码子的下游设计保守引物；设计的引物为：上游引物P1：5′‑CCCCGCGGCTGGAAGATGTG‑3′下游引物P2：5′‑TCCACACTCCCACCCTCCTCA‑3′用cDNA为模板进行梯度PCR，优化PID1基因普通PCR的条件，温度为范围在50℃到65℃之间的8个温度点。PCR反应体系为10ul体系(5μL的2×Master Mix Tap，上下游引物各0.5μL，2μL的cDNA，2μL的ddH2O.)，反应条件为95℃预变性5min，38个循环(94℃，30s；61℃，40s；72℃，40s)，最后72℃ 7min；A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆。