[发明专利]用于检测野生型群体中的核酸突变体的方法和试剂盒

摘要

本发明内容涉及在丰富的序列变体中扩增和检测DNA序列的稀有变体，例如在过量的正常核酸靶序列中检测低水平体细胞突变和少数等位基因。

主权项

一种引物依赖性DNA扩增方法，其用于选择性扩增包含丰富的靶序列的第一变体的样本中的DNA靶序列的稀有第二变体，其中所述第二变体与所述第一变体相异至少一个核苷酸，所述方法包括a)制备包含所述样本和扩增试剂的反应混合物，所述扩增试剂包括将所述靶序列包括在其间的第一线性引物和第二线性引物，和其在所述靶序列上的结合位点在所述第一引物的所述靶结合位点下游并且包括所述至少一个核苷酸差异的额外的引物阻断发夹型寡核苷酸，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸的所述靶结合序列优选地与所述靶序列的所述第一变体完全互补，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸的所述靶序列上的所述结合位点与所述第一引物的所述靶序列上的所述结合位点重叠至少一个核苷酸，其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸在扩增开始时具有比其针对所述靶序列的所述第二变体的对应解链温度高至少5℃的针对所述靶序列的所述第一变体的浓度调节的解链温度，并且其中所述引物阻断发夹型寡核苷酸在所述引物不与所述靶序列杂交的温度下但以为所述第一引物结合所述靶序列的速率的至多1/5的速率与所述靶序列的所述第一变体杂交；和b)使所述反应混合物经历热循环方案，所述热循环方案包括解链、引物退火和引物延伸的步骤的重复循环，其中至少所述初始循环在所述引物退火步骤之前另外包括阻断剂结合步骤，所述阻断剂结合步骤具有这样的温度，在该温度下所述引物阻断发夹型寡核苷酸仅结合所述靶序列的所述第一变体并且所述引物不结合所述靶序列，以及该温度具有足以使所述引物阻断发夹型寡核苷酸饱和所述靶序列的所述第一变体的持续时间，并且其中所述引物退火步骤具有不足以使所述引物阻断发夹型寡核苷酸结合所 述靶序列的所述第二变体的持续时间。