[发明专利]一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法

摘要

本发明公开了一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于包括以下步骤：①种子的消毒、②种子的萌发培养、③外植体制备、④固体共培养基的制备、⑤农杆菌侵染液的制备、⑥农杆菌侵染和共培养、⑦芽诱导和抗性植株的获得。本发明在农杆菌介导大豆子叶节外植体的侵染过程中，在外植体与农杆菌的共培养期的固体培养基中添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制剂，抑制大豆异黄酮合成的关键酶PAL，减少大豆异黄酮类次生代谢产物的合成和积累，从而降低大豆外植体的“免疫力”，提高农杆菌的被侵染力，通过改善这种植物/农杆菌互作关系大大提高了大豆抗性植株的数量和遗传转化效率。

主权项

一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于包括如下步骤：①种子的消毒：取健康饱满大豆种子，放入含有100ml 30％次氯酸钠和4ml浓盐酸的密闭容器内，利用反应生成的氯气消毒24～36小时；②种子的萌发培养：将步骤①中的种子接种到B5萌苗培养基中进行为期5～6天的25℃、16/8h光暗周期的培养；③外植体制备：将步骤②中的种子在无菌条件下去掉种皮、切掉幼叶和上胚轴，保留0.5～2.0cm的下胚轴，用手术刀片对子叶节部位进行创伤处理；④固体共培养基的制备：向经过121℃高压灭菌15min后的含有B5大量元素、B5微量元素、6‑BA、IBA、MES、蔗糖、琼脂，PH 5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠，DTT，半胱氨酸，B5有机成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中；⑤农杆菌侵染液的制备：将含有外源基因的重组农杆菌悬于含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、1×B5有机成分6‑BA1.0mgL‑1、IBA 0.2mg L‑1、MES 3.9g L‑1、蔗糖30g L‑1，乙酰丁香酮AS 200μM，PH 5.4的培养基中，调节菌液浓度到OD600≈0.5，室温静置半小时备用；⑥农杆菌侵染和共培养：将步骤③中的外植体放入100ml三角瓶中，加入步骤⑤制备的农杆菌侵染液中，摇床上80rpm低速转动30分钟后，取出外植体，用灭菌滤纸吸掉多余菌液，摆放到步骤④中固体共培养培养基上，暗培养3～5天；⑦芽诱导和抗性植株的获得：将步骤⑥中的外植体转移到恢复培养基上培养7天后，转移到带有筛选压的芽诱导培养基上培养14～21天，然后将诱导出抗性芽的外植体转移到芽伸长培养基上进行芽伸长，芽长4～5cm时转移到生根培养基中，获得转化再生植株移栽到花盆中获得转化的抗性植株。