[发明专利]一种测量小于衍射极限距离的光学成像方法

摘要

一种测量小于衍射极限距离的光学成像方法，属于超高分辨率显微成像的方法。以显微镜为成像平台，以成像检测器为记录仪，以有闪烁(blinking)现象的衍射极限距离内的发光个体为测量对象，以光栅为识别手段，可以测量10－200纳米距离内的发射不同波长的发光个体之间的距离。具体方案步骤是：（1）在检测器前放置光栅进行光谱成像；（2）记录不同发光个体的一级条纹的“明”与“暗”；（3）超分辨定位发光波长不同的发光体中心；（4）光学平台漂移的校正。本发明不需要复杂的光学技术和专业的操作者，对任何具有闪烁现象的多色发光体均可适用。

主权项

一种测量小于衍射极限距离的光学成像方法，以显微镜为成像平台，以成像检测器为记录仪，以有闪烁现象的衍射极限距离内的发光个体为测量对象，以光栅为识别手段，可以测量10－200纳米距离内的发射不同波长的发光个体之间的距离；其特征在于：光栅对有闪烁现象的不同发光波长的发光个体进行光谱识别，分别超分辨定位；所述发光个体是荧光分子，量子点，银簇，碳点，发光纳米颗粒；所述的光栅是透射光栅、反射光栅；所述发光波长在可见光范围内即300－800纳米；基于光栅分光的超分辨定位，具体实施方案为：（1）、构建标尺：选用发射波长不同的红色与绿色量子点（QD）荧光标记物，分别与两条互补的单链DNA连接，形成“单链DNA‑量子点（ssDNA‑QD）”交联物；将两种颜色的“单链DNA‑量子点”交联物混匀，杂交，形成“红色量子点‑DNA‑绿色量子点（QDred‑DNA‑QDgreen）”复合物；DNA长度、量子点半径已知，该标尺长度已知；（2）、成像装置： 在成像检测器前放置透射光栅，利用透射光栅分光原理，实现不同发射波长的荧光标记物的光谱成像；成像检测器安置在显微镜上；（3）、超分辨定位：用成像装置连续拍摄“红色量子点‑DNA‑绿色量子点”样品，当图片中只有一个一级条纹时，表明此时只有一种颜色的量子点发光，则其零级光斑可用于此发光量子点的超分辨定位；同样，当只出现另一条一级条纹时，另一种量子点亦可超分辨定位；这样即可分别定位两种量子点中心；（4）、漂移的校正：在进行分析的图片上选取一单色发光点作为参考点，该参考点中心随时间的变化即为平台漂移，根据不同帧图片中心的移动轨迹来校正光学平台的漂移；然后计算量子点间的距离；（5）、定位准确性：按照上述1‑5步，测量三种不同长度DNA间的不同颜色量子点的距离；用三种不同距离与三种不同碱基对作图，线性回归计算碱基对的距离，考量定位的准确性；所述的三种不同长度分别为15个碱基对15bp；或者为30个碱基对30bp，或者为45个碱基对45bp。