[发明专利]一种梅花鹿朊蛋白免疫学检测方法

摘要

本发明涉及一种梅花鹿朊蛋白免疫学检测方法，属于生物检验检疫领域。制备鼠抗重组朊蛋白PrPres单克隆抗体、兔抗重组朊蛋白PrPres-His多克隆抗体，采取的包被抗体为兔抗梅花鹿重组朊蛋白PrPres-His多克隆抗体、检测抗体为鼠抗梅花鹿重组朊蛋白PrPres单克隆抗体，所用的Elisa的方式具有准确度高的优点，同时所受环境的限制较少，本发明可应用于制备梅花鹿朊蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒。

主权项

一种梅花鹿朊蛋白免疫学检测方法，其特下在于包括下列步骤：（一）、鼠抗重组朊蛋白PrPres单克隆抗体的制备如下：（a）、重组朊蛋白PrPres的制备：（1）制备重组朊蛋白PrPres基因的人工合成引物为：       FW: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG；       RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA；（2）提取梅花鹿总基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的基因，克隆至PMD‑18T‑Simple载体上，将PrPres基因片段插入表达载体pET‑Trx中构建重组表达质粒，pET‑Trx‑ PrPres； 将PrPres基因片段插入表达载体pET‑His中构建重组表达质粒，pET‑His‑ PrPres；（3）将重组表达质粒pET‑Trx‑ PrPres和pET‑His‑ PrPres转入BL21(DE3)中进行表达，得到两种重组融合朊蛋白PrPres‑Trx和PrPres‑His，表达条件为阳性克隆培养物以1%接种于LB培养基（50mg/L抗生素），37℃剧烈摇荡培养至OD600=0.6时加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，220r/min剧烈摇培4h，离心收集菌体，菌体重新PBS悬浮并经超声波裂解，离心分别收集上清和沉淀，通过SDS‑PAGE分别检测全菌、上清和沉淀，发现PrPres‑Trx和PrPres‑His分别以包涵体的形式大量表达；（4）切胶纯化方法，取500 μL包涵体提取液处理后不插样品梳直接上样， 按常规方法进行SDS‑PAGE，将胶浸入2 mol/L NaAc溶液中在摇床上染色1 h， 将染成银白色的含目的蛋白胶切割下来， 置于蒸馏水中在脱色摇床上摇 20 min， 脱去NaAc，之后将切下来的胶放在密封透析袋内，以电泳的方法使目的蛋白游离出来，将透析袋中的凝胶取出后，用PEG20000进行浓缩，做透析去除小分子，经SDS‑PAGE和Western blot鉴定后分装后放入‑80度冰箱备用；(b) 鼠抗重组朊蛋白PrPres单克隆抗体的制备：（1）动物免疫以复性的重组朊蛋白PrPres‑Trx免疫8 周龄Balb/c雌性小鼠, 100μg/只,皮下分点注射，首次免疫用弗氏完全佐剂（1:1）乳化抗原, 间隔3 周后,采用弗氏不完全佐剂（1:1）乳化抗原, 进行第 2、3 次免疫，最后加强免疫时,直接用免疫原进行腹腔注射；（2）间接ELISA 筛选方法以及阳性杂交瘤判断标准的建立分别以重组成熟朊蛋白PrPres‑His和空载体菌体蛋白pET‑His包被酶标板孔,以测定PrPres‑Trx免疫血清效价，以未免疫的小鼠血清和SP2/0细胞上清为阴性对照，分别测定492 nm 光吸收值，经过多次ELISA检测，确定最佳工作条件为：抗原的最适合包被浓度为25μg/ml，4℃包被过夜；阳性和阴性血清最佳工作浓度为1:800，37℃孵育1h； HRP二抗最佳工作浓度为1:4000，37℃孵育1h，以此建立了间接ELISA筛选方法；（3）阳性杂交瘤细胞株的建立和稳定性检测取加强免疫3d 后的小鼠脾细胞与SP2/0 细胞以5︰1 在PEG1500 的作用下融合, 以建立的间接ELISA 方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，通过多次克隆化和筛选后，获得一株能分泌单克隆抗体的为“3C6”， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5556，分类命名：产朊蛋白单克隆抗体细胞株，并用间接ELISA 法检测连续培养30 代以及冻存5 个月复苏后的阳性杂交瘤细胞的上清液，确定其分泌抗体的稳定性；（4）单克隆抗体生物学特性的鉴定按试剂盒说明书操作，经鉴定该单克隆抗体为 IgG2b型，以10%的梅花鹿脑匀浆包被Elisa板，以3C6纯化后单抗（1μg/ml）检测，同时以SP2/0细胞上清和鼠阴性血清为阴性对照，在492nm下读值，3C6反应孔与阴性孔P/N在12800倍稀释条件下仍大于2，说明该单克隆抗体具有识别天然结构梅花鹿朊蛋白的能力；（二）、兔抗重组朊蛋白PrPres‑His多克隆抗体的制备：    用重组朊蛋白PrPres‑His免疫雌性家兔，皮下3点注射，免疫剂量1mg/只/次，间隔14d免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐剂，第2、3次采用弗氏不完全佐剂，第3次免疫后14天心脏放血，37℃放置1小时后，4℃过夜，次日3000转离心15分钟，去上清，辛酸‑硫酸铵法纯化兔多抗血清，纯化后的IgG用PBS透析3次，用BCA法测定蛋白浓度，‑80℃冻存；（三）梅花鹿朊蛋白的检测步骤如下：(1)加入100μL浓度为5μg/ml兔抗重组梅花鹿朊蛋白PrPres‑His多克隆抗体包被ELISA反应板，4℃孵育12小时；(2)取梅花鹿脑组织0.5g,加入4.5ml组织蛋白裂解液，制备成10%组织匀浆，每1毫升组织匀浆加入10mg蛋白酶K，37℃孵育1小时；(3)取出包被后的ELISA板用TBST洗5次，每次5分钟；(4)每孔加入300μL封闭液：3%BSA＋3%明胶，37℃孵育2小时；(5)用TBST洗5次，每次5分钟；(6)每孔加入100μL待检组织匀浆，37℃孵育1小时；(7)用TBST洗5次，每次5分钟；(8)每孔加入100μL浓度为1.25μg/ml辣根过氧化物酶标记的鼠抗重组梅花鹿朊蛋白单克隆抗体3C6， 37℃孵育1小时；(9)用TBST洗5次，每次5分钟；(10)加入底物，37℃避光孵育10分钟；(11)每孔加入50μL 2M硫酸终止反应；(12)读板，记录OD值；(13)根据标准曲线，计算组织匀浆中梅花鹿朊蛋白的含量。