[发明专利]一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法

摘要

一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，利用分离培养基分离玉米青枯病腐霉菌，包括引物设计及合成、玉米青枯病腐霉菌DNA的提取、目的基因的扩增及分离和扩增终产物的分离、进行测序鉴定，并在基因库Genbank进行比对，确定为玉米青枯病腐霉菌，本发明利用分离培养基分离玉米青枯病腐霉菌的方法，其鉴定方法操作简单，鉴定结果迅速准确，可以应用到实际生产中。

主权项

一种分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，其特征在于：分离玉米青枯病原腐霉菌所用的分离培养基的原料由琼脂、葡萄糖、马铃薯、酵母浸膏和复合抗生素母液组成，各原料的加入量是：15—30g的琼脂、15—30g的葡萄糖、150—300g的马铃薯、0.8—1.5g的酵母浸膏和0.4—0.7mL的复合抗生素母液；利用分离培养基分离玉米青枯病原腐霉菌的方法，包括以下步骤为：步骤一、抗生素培养基的配制1）在浓度为80万U/瓶的青霉素钠中加入无菌去离子水，混合均匀，制得浓度为20万U/mL的母液a，备用；2）在浓度为100万U/瓶的硫酸链霉素中加入无菌去离子水，混合均匀，制得浓度为20万U/mL的母液b，备用；3）按重量份数比取1份的浓度为20万U/mL的母液a和1份的浓度为20万U/mL的母液b，混合均匀，制得浓度为10万U/mL的复合抗生素母液，备用；步骤4）在4000mL的水中加入400‑600g的马铃薯，煮30—40分钟，过滤，得到马铃薯滤液，备用；步骤5）在1500mL的马铃薯滤液中加入15—30g的琼脂、15—30g的葡萄糖和0.8—1.5g的酵母浸膏，加热至80—90℃，使琼脂溶解，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基煮至1000mL时，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶100mL，后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1.05kg/cm2，温度为121℃，灭菌40分钟，取出，后在21℃条件下冷却至60℃止，在每个含有酵母浸膏马铃薯葡萄糖琼脂培养基的三角瓶内加入0.4—0.7mL步骤3）中得到的复合抗生素母液，混合均匀，使每个三角瓶内的抗生素浓度为20U/mL，制得抗生素培养基，后将抗生素培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内抗生素培养基的含量为30mL，放置40分钟，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板，备用；步骤6）取步骤4）中得到的1000mL马铃薯滤液，在滤液中加入15—30g的琼脂、15—30g的葡萄糖，0.8—1.5g的酵母浸膏，加热至80—90℃，使琼脂溶解，后将溶液定容至1000mL，形成含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，后将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基分装于10个三角瓶中，每瓶100mL，然后将每个三角瓶放入高压灭菌锅内，在压强为1.05kg/cm2，温度为121℃，灭菌40分钟，取出，后在21℃条件下冷却至60℃止，将含有酵母浸膏的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿内，每个培养皿内含有30mL的培养基，得到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，备用；步骤二、病原菌的萌发1）将含有病原菌的玉米杆，剥离叶片，用保鲜膜将玉米杆包装好并放于10℃条件下，放置3天；2）用75%的酒精将含有病原菌的玉米杆外侧消毒，剪成10cm的小段，剖开玉米茎杆，将病变组织暴露，取三个直径为1cm的病变组织块，将病变组织块接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂抗生素分离平板中，在28℃条件下，培养3‑5天，得到萌发后的病原菌，备用；步骤三、在步骤一中得到的加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内，接种步骤二中得到的萌发后的病原菌，在28℃条件下，培养3‑5天，得到纯化后的菌株，备用；步骤四、依据步骤三的方法，在加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板内接种步骤三得到的纯化后的菌株，在28℃条件下，培养3‑5天，进一步纯化得到玉米青枯病原腐霉菌株，备用；步骤五、将步骤四中的得到全部玉米青枯病原腐霉菌接种到加富马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在28℃条件下，培养6天，得到玉米青枯病原腐霉菌丝，即分离得到玉米青枯病原腐霉菌。