[发明专利]一种测定酵母蛋白酶A活性的方法

摘要

一种测定酵母蛋白酶A活性的方法，属于发酵工程领域。本发明利用共振光散射技术建立起一种测定酵母蛋白酶A活性的新方法。根据三氯乙酸可以与微量蛋白质缔合形成缔合微粒，并且此微粒的浓度在一定条件下与共振散射光强度呈正比关系的原理，用三氯乙酸缔合酵母蛋白酶A与底物酪蛋白反应前后溶液中的蛋白质，用荧光分光光度计测定其光强，根据酪蛋白的降解量得到酵母蛋白酶A活性。此方法具有检测限低、灵敏度好、稳定性高、线性范围宽、受干扰物影响小，并且快速简便、检测成本低，可以满足测定发酵液和啤酒中微量蛋白酶A活性的要求，具有较大潜力，为酵母蛋白酶A的深入研究提供可靠基础。

主权项

一种测定酵母蛋白酶A活性的方法，其特征是：根据三氯乙酸可以与微量蛋白质缔合形成缔合微粒，并且此微粒的浓度在一定条件下与共振散射光强度呈正比关系的原理，用三氯乙酸缔合酵母蛋白酶A与底物酪蛋白反应前后溶液中的蛋白质，用荧光分光光度计测定其光强，根据反应前后测得的酪蛋白降解量得到酵母蛋白酶A的活性；该方法包括下列步骤：a.试剂的制备酪蛋白溶液：用酸性缓冲溶液配制一定浓度的酪蛋白溶液，为保证溶液澄清，可对溶液进行过滤处理；三氯乙酸溶液：一定质量的三氯乙酸溶于蒸馏水，定容；b.酶液的制备将一定质量的酵母泥用缓冲液进行自溶，离心，取上清液为粗酶液；一定体积纯生啤酒或发酵液用硫酸铵盐析，离心，沉淀用水溶解并定容，离心，取上清液即为粗酶液；c.催化反应在试管中加入粗酶液，再加入酪蛋白溶液，混匀，一定温度反应一定时间后，加入三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐，混匀，缔合一定时间；空白为在酶液中先加入三氯乙酸中止一定时间后，再加入酪蛋白溶液，加蒸馏水将体系体积补齐；d.共振光强度测定设定荧光分光光度计的发射光波长、激发光波长以及狭缝，对上述反应液进行读数；e.绘制标准曲线及酶活计算在试管中分别加入不同浓度的酪蛋白溶液，再加入三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐，混合均匀，一定温度下反应一定时间。设定荧光分光光度计的发射光波长、激发光波长以及狭缝，对上述反应液进行读数，以酪蛋白浓度为横坐标，以共振散射光强度为纵坐标作图，得到标准曲线；根据样品的共振散射光强度值，在标准曲线上可以读出对应降解的酪蛋白质量，然后将其换算成酶活；酶活的定义：在一定温度和pH条件下，一定时间内降解一定质量的酪蛋白的酶量定义为一个酶活单位。