[发明专利]一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法及专用酿酒酵母菌株

摘要

本发明公开了一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，是通过宿主菌改造、分泌表达载体构建、重组菌株构建、菌株培养、酶活测定，实现提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白尤其是分子量大且二硫键丰富的异源蛋白。本发明还提供了所述方法中专用的提高异源蛋白分泌表达的重组酿酒酵母菌株，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSX010，已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5748。

主权项

一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，步骤是：(1)宿主菌改造：以单倍体双缺菌株CEN.PK102‑3A为出发酿酒酵母菌株，利用Cre‑loxP系统敲除P‑型Ca2+/Mn2+ATPase基因Sc‑PMR1和蛋白质误分拣途径受体基因Sc‑VPS10，通过构建整合型表达载体pYMIKP‑SSO1‑PDI1实现二硫键异构酶基因Sc‑PDI1和质膜t‑SNARE基因Sc‑SSO1在基因组上的过表达，获得对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白分泌能力提高的重组酿酒酵母菌株BSX010；(2)分泌表达载体构建：以pJFE2为空质粒构建重组质粒pJCF，获得包含有异源蛋白的分泌表达载体；(3)重组菌株构建：将步骤(2)构建的分泌表达载体分别转化到出发酿酒酵母菌株CEN.PK102‑3A和步骤(1)所得重组酿酒酵母菌株BSX010中，并通过筛选得到转化成功的转化子，即建立表达异源蛋白的常规菌株和待检测菌株；(4)菌株培养：对步骤(3)所述常规菌株和待检测菌株分别进行常规培养，收集菌液；(5)酶活测定：将上述分别收集的菌液离心，取上层培养液进行异源蛋白胞外酶活测定；(6)判断：以对常规菌株测定的异源蛋白胞外酶活值为基准，判定待检测菌株异源蛋白的分泌表达是否得到提高。