[发明专利]提高富马酸产量的基因工程菌株及构建方法及其应用

摘要

本发明公开了提高富马酸产量的基因工程菌株及构建方法及其应用，构建方法为：(1)乳酸脱氢酶基因ldhL的克隆；(2)包含真菌启动子序列、反向ldhL基因序列以及终止子序列的重组片段构建；(3)潮霉素抗性基因的克隆；(4)含有抗性基因重组基因片段的构建；(5)重组质粒的构建；(6)重组根癌脓杆菌的获得；(7)重组米根霉菌株的获得：本发明的菌株在充分好氧条件下利用葡萄糖发酵高浓度积累富马酸，与野生米根霉菌株相比，副产物乳酸含量低，生产富马酸的最终发酵浓度和生产强度得到显著提高，缩短了生产时间，从而降低了发酵液中富马酸的分离难度和分离成本，为微生物发酵法工业化生产生物基来源的富马酸奠定了良好的基础。

主权项

提高富马酸产量的基因工程菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)乳酸脱氢酶基因ldhL的克隆：以提取的米根霉细胞基因组DNA为模板，分别以序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为上、下游引物，进行PCR反应，扩增出SEQ ID No.5所示的乳酸脱氢酶ldhL基因序列，提纯，将提纯后的乳酸脱氢酶ldhL基因序列与pMD18‑simple‑T载体连接，得到重组pMD18‑simple‑T载体，进行序列测定，酶切所述重组pMD18‑simple‑T载体，得到包含酶切位点的ldhL基因片段；(2)包含真菌启动子序列、反向ldhL基因序列以及终止子序列的重组片段构建：利用Not I，Xho I将步骤(1)获得的片段反向插入到SEQ ID No.7所示的质粒pGAPZB启动子的下游，获得重组质粒pGAPZB‑ldhL，用Bgl II，BamH I酶切重组质粒pGAPZB‑ldhL，得到包含真菌启动子序列、反向ldhL基因序列以及终止子序列AOX1的重组片段pGAP‑ldhL‑AOX1；(3)潮霉素抗性基因的克隆：以SEQ ID No.8所示的质粒pDx‑Los为模板，以序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为上、下游引物，PCR扩增潮霉素抗性基因，将PCR扩增产物提纯，与pMD18‑simple‑T载体连接，得到重组pMD18‑simple‑T载体，酶切所述重组pMD18‑simple‑T载体，得到SEQ ID No.6所示的包含酶切位点的潮霉素抗性基因片段；(4)含有抗性基因重组基因片段的构建：将步骤(2)获得的重组片段与步骤(3)获得的基因片段利用BamH I位点进行连接，用限制性内切酶EcoR I验证片段连接顺序，筛选潮霉素抗性基因片段位于pGAP‑ldhL‑AOX1片段下游的连接子，得到重组片段pGAP‑ldhL‑AOX1‑chaoR；(5)重组质粒的构建：利用限制性内切酶位点BamH I，Hind III将所述重组片段pGAP‑ldhL‑AOX1‑chaoR插入质粒pCAMB3300，得到重组质粒p CAMB3300‑pGAP‑ldhL‑AOX1‑chaoR；(6)重组根癌脓杆菌的获得：将步骤(5)获得的重组质粒p CAMB3300pGAP‑ldhL‑AOX1‑chaoR通过电击直接转化根癌脓杆菌LBA4404，涂布含50μg/mL的卡那霉素LB平板培养基，挑取阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，得到含有重组质粒p CAMB3300pGAP‑ldhL‑AOX1‑chaoR的根癌脓杆菌基因工程菌株，命名为Agrobacterium tumefaciens LBA4404‑pCAMB3300‑pGAP‑ldhL‑AOX1‑chaoR；(7)重组米根霉菌株的获得：①将步骤(6)获得的菌株接种于含卡那霉素、利福霉素和链霉素的LB培养基中，28‑32℃，180‑220r/min摇床培养30‑42h，离心收集菌体，用等体积的IM培养基重悬经离心后的 菌体，培养5‑8h，使菌细胞终浓度达到1011‑1012个/mL；所述卡那霉素在LB培养基中的浓度为40‑60μg/mL，所述利福霉素在LB培养基中的浓度为40‑60μg/mL，所述链霉素在LB培养基中的浓度为20‑40μg/mL；②将米根霉孢子液接种于YPD固体培养基中，33‑35℃培养6‑8天；用无菌水洗脱收集新鲜孢子，重悬于用20g/l的无菌CaCl2水溶液中，使米根霉孢子浓度达到108‑109个/mL；取步骤①和②获得的重悬菌液各50μL加入含有乙酰丁香酮、卡那霉素和潮霉素的IM培养基中，在28‑32℃，180‑220r/min培养12‑16h；稀释10‑6倍，取200μL稀释液涂布铺有玻璃纸的IM+AS培养基平板，并置于33‑35℃培养40‑50h；将玻璃纸转接到含有潮霉素的YPD培养基上培养90‑100h，筛选阳性米根霉基因工程菌株，并进行基因水平上的分子鉴定，命名为Rhizopus oryzae CM 08/LDH‑，所述乙酰丁香酮在IM培养基中的浓度为200μmol/L，卡那霉素在IM培养基中的浓度为50μg/mL，潮霉素在IM培养基中的浓度为50μg/mL，所述潮霉素在YPD培养基中的浓度为50μg/mL。