[发明专利]一种肠道病毒检测试剂盒

摘要

本发明提供一种肠道病毒检测试剂盒，包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品、阳性对照品、阴性对照品。本发明根据CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒的保守区序列设计特异性的引物和探针，采用一步法四重实时荧光定量RT-PCR技术，可快速、准确的从标本中同时检测出CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他肠道病毒，并实时准确定量，尤其对属于肠道病毒属的CoxB1、CoxB2、CoxB3进行双重验证，使检测结果更为准确。

主权项

一种肠道病毒检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：定量RT‑PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、CoxB1标准品、CoxB2标准品、CoxB3标准品、肠道病毒标准品、CoxB1阳性对照品、CoxB2阳性对照品、CoxB3阳性对照品、肠道病毒阳性对照品、阴性对照品，盒体(7)设有容器孔，分别放置定量RT‑PCR反应液管(1)、酶混合液管(2)、引物探针混合液管(3)、阴性对照品管(4)、标准品管(5)、阳性对照品管(6)，标准品管(5)有4管，分别放置CoxB1标准品、CoxB2标准品、CoxB3标准品、肠道病毒标准品，阳性对照品管(6)有4管，分别放置CoxB1阳性对照品、CoxB2阳性对照品、CoxB3阳性对照品、肠道病毒阳性对照品；其中定量RT‑PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液含四种病毒的特异性引物和相应的四种不同荧光标记的探针，引物探针混合液管需为棕色管，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为CoxB1、CoxB2、CoxB3及肠道病毒的阳性质粒样品；检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列为：上游引物CoxB1‑F：5’‑CACTCACGGTCCGAATCRTCCA‑3’下游引物CoxB1‑R：5’‑TTTYTGAGTTRTTRGTGTATGTGGCAT‑3’特异性探针CoxB1‑P：5’‑FAM‑TTCCTGTGCCGGTCTGCCTGTGT‑BHQ1‑3’上游引物CoxB2‑F：5’‑GATCAGCATGTGTGTTTTACACGA‑3’下游引物CoxB2‑R：5’‑GCCTGTCTAACACTCACCTTCCA‑3’特异性探针CoxB2‑P：5’‑CY5‑TACACCAACAGCAAAAATGCAGCCAA‑BHQ2‑3’上游引物CoxB3‑F：5’‑CCAGTAMCAGATAAAGTGGATTCRTA‑3’下游引物CoxB3‑R：5‑AGGAARGGTATRGACATGCGTG‑3’特异性探针CoxB3‑P：5’‑HEX‑CCAAGTGTGTTCTGGACAGAGGGTAATGC‑BHQ1‑3’上游引物肠道病毒‑F：5’‑CCCTGAATGCGGCTAATCC‑3’下游引物肠道病毒‑R：5’‑ATTGTCACCATAAGCAGCCA‑3’特异性探针肠道病毒‑P：5’‑ROX‑AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC‑BHQ2‑3’CoxB1标准品序列为：ACGTGAAAAA    CTACCACTCA    CGGTCCGAAT    CGTCCATTGA    AAATTTCCTGTGCCGGTCTG    CCTGTGTATA    CTATGCCACA    TACACCAATA    ACTCAGAAAAGGGGTTTGCA    GAGTGGGTTACoxB2标准品序列为：ATTTCCTTGC    ACGATCAGCA    TGTGTGTTTT    ACACGACATA    CACCAACAGCAAAAATGCAG    CCAAAGAAAA    GAAGTTTGCG    ACATGGAAGG    TGAGTGTTAGACAGGCTGCA    CAACTGACoxB3标准品序列为： ACCAGGGGGT    CCAGTAGCAG    ATAAAGTGGA    TTCATATGTA    TGGCAAACTTCCACGAACCC    AAGTGTGTTC    TGGACAGAGG    GTAATGCACC    ACCACGCATGTCCATACCTT    TCCTGAGCAT    TGG肠道病毒标准品序列为：AGTCCTCCGG    CCCCTGAATG    CGGCTAATCC    CAACTGCGGA    GCACACGCCCACAAGCCAGC    GGGTAGTGTG    TCGTAACGGG    TAACTCTGCA    GCGGAACCGACTACTTTGGG    TGTCCGTGTT    TCCTTTTATC    TTTATATTGG    CTGCTTATGGTGACAATTAA    AGAATT。