[发明专利]一种堆肥发酵滤液对土壤线虫多样性的防控方法

摘要

本发明公开了一种堆肥发酵滤液对土壤线虫防控的方法，它是在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土中加入150μl不同浓度的含有苏云金芽孢杆菌的堆肥微生物发酵滤液，对照组加入无菌液体培养基，每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，待种子萌发后测定各项指标。实验结果表明：向草坪土壤基质中加入苏云金芽孢杆菌发酵液不仅可以抑制土壤线虫的总量，抑制植物寄生类线虫的生长，改变土壤线虫的群落组成，同时可以增强草坪植物的抗逆性，促进草坪植物的生长。

主权项

一种堆肥发酵滤液对土壤线虫多样性的防控方法，其特征在于按如下的步骤进行：(1)苏云金芽孢杆菌的分离：1）将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取lml母液，加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为l0‑1浓度的稀释溶液，按此方法分别稀释成l0‑2、l0‑3、l0‑4、l0‑5、l0‑6几种浓度的堆肥稀释液；分别用移液枪吸取0.1毫升浓度为l0‑2、l0‑3、l0‑4、l0‑5、l0‑6稀释液，注入到牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上，每一稀释度重复三次，无菌水为空白对照；用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整牛肉膏蛋白胨固体培养基上，使微生物均匀分布，将含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养1天；2）苏云金芽孢杆菌发酵液的制备：A.将分离出的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养2代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养，选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，根据生长曲线获得苏云金芽孢杆菌生长至稳定期的时间；B.取纯化苏云金芽孢杆菌菌种，接入装有50mL高氏一号液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37℃培养8～12 h至稳定期，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液进行抽滤，抽滤后将菌液通过孔径为0.22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液；3）稀释苏云金芽孢杆菌发酵液：取一部分过滤液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用；4）堆肥发酵滤液对土壤线虫防控：以高14cm直径20cm塑料花盆为容器构建草坪建植体系，每个花盆中分别加入2kg草坪土壤，播种饱满的高羊茅草种3g，待草坪植物生长5cm时，分别向花盆中加入10ml 苏云金芽孢杆菌发酵液，草坪培植75d后，分离鉴定各处理线虫的种类及数量，分析线虫多样性特征；其中的纯化培养2代培养指的是：用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养1天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代。