[发明专利]提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用

摘要

本发明公开了一种提取堆肥宏基因组DNA的方法及其在鉴定反硝化细菌中的应用。本发明的方法包括如下步骤：(1)将堆肥样品在DNA提取液中进行物理裂解；(2)加入溶菌酶；(3)加入蛋白酶K；(4)加入SDS水溶液；(5)离心收集上清液；(6)在步骤(5)的沉淀中加入DNA提取液和SDS水溶液，离心收集上清液；(7)将步骤(5)和步骤(6)的上清液合并；(8)酚-氯仿-异戊醇抽提；(9)将步骤(8)的上清液和异丙醇混匀，收集沉淀，即为堆肥宏基因组DNA。本发明对于研究不同发酵时间的堆肥样本中的细菌种类(特别是反硝化细菌种类)具有很高的应用价值。本发明为堆肥的研究和应用，以及微生物分子生态学研究提供了有效的技术支撑。

主权项

一种提取堆肥宏基因组DNA的方法，包括如下步骤：(1)将堆肥样品和DNA提取液置于离心管中进行物理裂解；所述物理裂解包括2‑4次如下步骤：液氮处理10‑20min，然后63‑67℃水浴融化；(2)在完成步骤(1)的离心管中加入溶菌酶，36‑38℃水浴25‑35min；(3)在完成步骤(2)的离心管中加入蛋白酶K，36‑38℃水浴25‑35min；(4)在完成步骤(3)的离心管中加入18‑22g/100ml的SDS水溶液，63‑67℃水浴100‑140min；(5)将完成步骤(4)的离心管18‑22℃、12000‑14000g离心13‑17min，收集上清液；(6)在完成步骤(5)的离心管中加入DNA提取液和18‑22g/100ml的SDS水溶液，63‑67℃水浴8‑12min，然后18‑22℃、12000‑14000g离心13‑17min，收集上清液；(7)将步骤(5)的上清液和步骤(6)的上清液合并；(8)将步骤(7)的上清液和酚‑氯仿‑异戊醇混合液等体积混合，混匀后18‑22℃、12000‑14000g离心8‑12min，收集上清液；所述酚‑氯仿‑异戊醇混合液是将25体积份苯酚、24体积份氯仿和1体积份异戊醇混合得到的；(9)将步骤(8)的上清液和异丙醇混匀，18‑22℃沉淀50‑70min，收集沉淀，即为堆肥宏基因组DNA；步骤(8)的上清液和异丙醇的体积比为1∶0.5‑0.7。