[发明专利]p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法及其在损伤中枢神经再生与功能恢复中的应用

摘要

本发明属于生物医学领域，特别涉及p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备及应用。该p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制备方法能够提高p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表达效率和生物活性，p75NTR-ED-Fc融合蛋白能够用于促进损伤中枢神经再生与功能恢复。

主权项

p75NTR‑ED‑Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：（1）p75NTR‑ED‑Fc原核表达载体的构建与鉴定以真核表达载体pcDNA‑p75NTR‑ED‑Fc质粒为模板，根据Genebank中编号为NM_002507.1的p75NTR核苷酸序列及编号为XM_002348257.1的IgG的Fc段核苷酸序列分别设计特异的p75NTR正向引物和半特异的p75NTR/Fc反向引物，并在引物两端分别引入Kpn I、Xho I酶切位点及相应的保护碱基，经PCR扩增得到p75NTR‑ED‑Fc片段，引物序列如下：Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'Kpn I酶切位点Reverse primer: 5' CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3'                  Xho I酶切位点PCR扩增获得的p75NTR‑ED‑Fc片段，经Kpn I和Xho I双酶切后回收纯化并将其克隆于同样双酶切的pET32a+表达载体中，最终获得含硫氧还蛋白及His标签的pET‑p75NTR‑ED‑Fc原核表达载体，对获得的pET‑p75NTR‑ED‑Fc重组表达质粒进行PCR、酶切和测序鉴定验证其插入序列的准确性；（2）Trx‑p75NTR‑ED‑Fc融合蛋白的诱导表达将鉴定正确的重组质粒pET‑p75NTR‑ED‑Fc转化至E.coli BL‑21 pLys感受态细胞中，挑选白色克隆于LB培养基中，35～39℃，220～280rpm振荡培养约4～7小时，在OD600达到0.5～1.0时加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mmol/L，继续诱导表达12～20小时，高速冷冻离心机离心收集培养好的菌体后重悬于Tris‑HCl缓冲液中，然后用超声破菌，离心，SDS‑PAGE电泳初步检测菌体上清及沉淀中蛋白的表达情况；（3）Trx‑p75NTR‑ED‑Fc融合蛋白的纯化取步骤（2）所得上清，利用His‑tag亲和层析柱纯化破菌上清中的目标融合蛋白Trx‑p75NTR‑ED‑Fc，将该纯化后的目标融合蛋白Trx‑p75NTR‑ED‑Fc通过脱盐柱除去溶液中的咪唑和NaCl；（4）酶切除去Trx在纯化后的融合蛋白Trx‑p75NTR‑ED‑Fc溶液中加入重组牛肠激酶，酶切除去Trx，获得p75NTR‑ED‑Fc融合蛋白；（5）p75NTR‑ED‑Fc融合蛋白的纯化利用His‑tag亲和层析柱对酶切后的融合蛋白p75NTR‑ED‑Fc进行纯化，得到含有切去融合标签Trx的融合蛋白p75NTR‑ED‑Fc，利用阴离子交换层析柱对所得融合蛋白p75NTR‑ED‑Fc进一步纯化，并进行SDS‑PAGE分析和Western blot鉴定，将纯化后的融合蛋白采用透析缓冲液透析到保存缓冲液中，获得最终蛋白产品。