[发明专利]一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法

摘要

本发明涉及一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，属于核酸应用技术领域。本发明的提取方法中，先后依次向含抗凝剂的血液中加入各种试剂，包括缓冲液A，缓冲液B，蛋白酶K，异丙醇，70％乙醇及洗脱缓冲液C，经过细胞裂解、异丙醇结合、核酸洗涤和核酸洗脱，最后得到脱氧核糖核酸溶液。本发明方法基于调整盐浓度和pH值的原理，操作步骤简便，节省了大量时间，同时获得了高质量的大片段DNA，而且产量高，可满足下游的多种应用。

主权项

一种快速的大片段基因组脱氧核糖核酸提取方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)向含抗凝剂的血液中加入体积为血液初始体积1‑2倍的缓冲液A，颠倒混匀5次，得到第一混合液，对第一混合液进行离心分离，在2000×g离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀，所述的缓冲液A的组成为：柠檬酸钠75‑150毫摩尔/升，吐温‑20质量体积比为2‑10％，采用柠檬酸调pH值至7.0；(2)在上述细胞沉淀中加入体积为血液初始体积1‑2倍的缓冲液A，颠倒混匀5次，得到第二混合液，对第二混合液进行离心分离，在2000×g离心分离5分钟，倒弃上清液，留下细胞沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保细胞沉淀在管中；(3)配制缓冲液B和蛋白酶K的混合液，缓冲液B和蛋白酶K的体积比为100∶1，得到第三混合液，所述的缓冲液B的组成为：盐酸胍2‑4摩尔/升，pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸10‑50毫摩尔/升，采用盐酸调pH值7.0；(4)在上述步骤(2)的细胞沉淀中加入体积为血液初始体积1/2的第三混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，得到第四混合液；(5)将第四混合液于65摄氏度水浴10‑30分钟，同时颠倒混匀数次；(6)向第四混合液中加入体积为血液初始体积1/2的异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组脱氧核糖核酸，得到第五混合液；(7)对第五混合液进行离心分离，在2000×g离心分离3分钟，倒弃上清液，留下脱氧核糖核酸沉淀，将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保脱氧核糖核酸沉淀在管中；(8)在上述步骤(7)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为血液初始体积1/2、体积百分比浓度为70％的乙醇，涡旋振荡5秒钟，在2000×g离心分离3分钟，倒弃上清液；(9)重复步骤(8)，最后将离心管倒置在干净的吸水纸上停留5分钟以上，使脱氧核糖核酸沉淀在管中；(10)在空气中使步骤(9)的脱氧核糖核酸沉淀干燥5分钟以上，直至所有的液体挥发干净；(11)在上述步骤(10)得到的脱氧核糖核酸中加入体积为血液初始体积1/10的洗脱缓冲液C，低速涡旋5秒，65摄氏度加热1小时，溶解后即脱氧核糖核酸溶液，所述的缓冲液C的组成为：pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸10毫摩尔/升，pH值为8.0的乙二胺四乙酸二钠盐1毫摩尔/升。