[发明专利]一种沙拉沙星的荧光偏振免疫分析检测方法

摘要

本发明公开了一种以合成的沙拉沙星荧光标记物为基础的沙拉沙星（Sarafloxacin,SAR）的荧光偏振免疫分析方法，属于荧光偏振免疫检测技术领域。本发明利用沙拉沙星作为半抗原偶联异硫氰酸荧光素FITC，合成荧光标记物，并以沙拉沙星为标准品，沙拉沙星多克隆抗体为抗体，建立了沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法。本发明分析方法的建立，为沙拉沙星的含量分析供了一种快速高效的分析手段。本发明方法操作简便、快速、成本低。IC50为43.23ng/mL，线性范围为5.7~327.6ng/mL。免疫分析的高特异性和亲和性使荧光偏振免疫分析方法具有极高的选择性和灵敏度。

主权项

一种沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于该方法利用沙拉沙星作为半抗原偶联FITC荧光素合成荧光标记物，并以沙拉沙星为标准品、沙拉沙星多克隆抗体为抗体，建立了沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法，步骤如下：(1)沙拉沙星荧光标记物的制备：a.称取3～4mgSAR溶于由100μL水、500μL甲醇、50μL三乙胺组成的混合溶剂中形成A液；b.称取6mg异硫氰酸荧光素(FITC)于600μL甲醇中形成B液；c.取200μLB液逐滴加入A液中，震荡，室温避光过夜；d.次日，以CHCl3∶MeOH＝2∶1(V/V)为展开剂，室温下对c步的反应液进行薄层层析，分离纯化得沙拉沙星荧光标记物；(2)沙拉沙星荧光标记物工作浓度的确定：用2.5mmol/L、pH＝8.0的硼酸盐缓冲液倍比稀释得到不同浓度的沙拉沙星荧光标记物，检测荧光偏振光强度，以5倍于空白溶液的偏振光强度所对应的浓度作为沙拉沙星荧光标记物的工作浓度；(3)沙拉沙星多克隆抗体的工作浓度的确定：在每个试管中依次加入500μL用2.5mmol/L、pH＝8.0的硼酸盐缓冲液稀释的比例分别为1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200的沙拉沙星多克隆抗体，并依次加入500μL步骤(2)确定的工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，混匀后室温孵育5min，检测荧光偏振光强度，以最大偏振值70％对应的抗体浓度作为抗体的最佳工作浓度；(4)竞争盐酸沙拉沙星用双蒸水稀释成系列溶液并分别加入试管中，另设一个双蒸水空白对照，40μL/管；每管加入480μL工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，最后分别加入480μL工作浓度的沙拉沙星多克隆抗体，混匀后室温孵育5min，检测其荧光偏振光强度；(5)建立沙拉沙星抗体的抑制率曲线以沙拉沙星浓度为横坐标，偏振光强度为纵坐标作图，建立沙拉沙星抗体的抑制率曲线；(6)交叉反应率甲醇溶解恩诺沙星、加替沙星；pH＝5‑6的稀醋酸溶解氧氟沙星；双蒸水溶解盐酸沙拉沙星、盐酸环丙沙星，配制1mg/mL的标准品溶液，按照一系列浓度，用蒸馏水进行稀释，分别加入到试管中，另设一个双蒸水空白对照，40μL/管；每管加入480μL工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，最后分别加入480μL工作浓度的沙拉沙星多克隆抗体，混匀后室温孵育5min，检测其荧光偏振光强度。(7)实际样品的检测取处理过的牛奶和猪尿40μL/管，再加入480μL工作浓度的沙拉沙星荧光标记物，最 后分别加入480μL工作浓度的沙拉沙星多克隆抗体，混匀后室温孵育5min，检测其荧光偏振光强度。