[发明专利]一种简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法

摘要

本发明涉及一种简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、选择培养、筛选培养、壮苗培养和生根培养；本发明的抑菌剂配制方法简单；培养基配制，只要按不同的培养基配方常规方法配制后，再加上抑菌剂即可；培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，这在以农杆菌介导的甘蔗转基因的培养基配制上，大大地减少了工作量和能源消耗，简化了组培环节，降低了组培成本，与常规的农杆菌介导甘蔗转基因方法对比，可以降低成本10%以上。本发明简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法，操作简单，实用性强，推广性好。

主权项

一种简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、选择培养、筛选培养、壮苗培养和生根培养，其特征在于：　 （1）抑菌剂的配制：抑菌剂1号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入20 ml蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，并用蒸馏水定容到100 ml，为抑菌剂1号；抑菌剂2号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入20 ml蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，加入6 g Timentin，并用蒸馏水定容到100 ml，为抑菌剂2号；所述Timentin为一种抗生素，由替卡西林钠与克拉维酸钾，按照重量比为15:1的比例组成，其中替卡西林钠纯度不低于99.1%，卡拉维酸钾纯度不低于99.2%；（2）培养容器消毒：将培养瓶及瓶盖在抑菌剂1号与水的体积比为0.3 %～0.5 %的水溶液中浸泡不少于10 h，保存备用；（3）农杆菌转化：选择携带bar基因的植物表达载体，导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105中、制备转化菌液、侵染甘蔗心叶；（4）培养基配制：共培养培养基为1/2MS+3.0 mg/L 2,4‑D+100 μmol/L 乙酰丁香酮+3～5 ml/L抑菌剂2号+20.0 g/L蔗糖+3.5 g/L琼脂粉，pH5.8；选择培养基为MS+3.0 mg/L 2,4‑D+3～5 ml/L抑菌剂2号+30.0 g/L蔗糖+3.5 g/L琼脂粉，pH5.8；筛选培养基为MS+2 mg/L 6‑BA+0.2 mg/L NAA+2～6 mg/L PPT+3～5 ml/L抑菌剂2号+30.0 g/L蔗糖+3.5 g/L琼脂粉，pH5.8；壮苗培养基为MS+0.5～1 mg/L 6‑BA+0.5～1 mg/L KT+3～5 ml/L抑菌剂2号+30.0 g/L蔗糖+3.5 g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+3 mg/L NAA+3～5 ml/L抑菌剂2号+40 g/L蔗糖+3.5 g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述2,4‑D，指2,4‑二氯苯氧乙酸；所述6‑BA，指6‑苄氨基嘌吟；所述NAA，指〆‑萘乙酸；所述KT，指6‑糠氨基嘌吟；配制培养基时，先不加抑菌剂2号，按各培养基配方配齐其他原料后，用蒸馏水定容、加热至琼脂粉完全溶解，然后按各培养基配方添加抑菌剂2号，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到培养容器中，封口，冷却凝固后备用；   （5）共培养：将侵染后的材料从转化菌液中取出后，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至共培养培养基上，在22 ℃黑暗条件下共培养3 d；（6）选择培养：将共培养后的材料移至选择培养基中，在28 ℃黑暗条件下培养二代，每14 d转接一次为一代；（7）筛选培养：将选择培养后的材料移至筛选培养基上，15 d部分愈伤组织分化出小芽；培养室温度为28 ℃，光照12 h，光照强度为1200 lx；（8）壮苗培养：将筛选培养后获得的小芽转到壮苗培养基上，15 d后形成小苗；培养室温度为28 ℃，光照12 h，光照强度为1200 lx；（9）生根培养：将壮苗培养后获得的小苗分成单株接种到生根培养基上，15～30 d即可形成完整植株；培养室温度为28 ℃，光照12 h，光照强度为1500 lx。