[发明专利]土壤中H9亚型禽流感病毒分子的检测方法

摘要

本发明公开了一种土壤中H9亚型禽流感病毒分子的检测方法，其步骤：A、根据报道的登录号为JN381629的H9亚型禽流感病毒HA基因序列设计引物对；B、待检土壤样品的处理：将同一地点不同位置所采的土壤混合，过20目分析筛，去除土壤中的石头及杂草；C、待检土壤样品中RNA的提取，使用土壤RNA提取试剂盒，提取土壤中的总RNA，D、病毒RNA的反转录，建立病毒RNA反转录体系；E、巢式PCR扩增目的基因：1）建立巢式PCR扩增反应体系；2）建立巢式PCR外侧引物扩增反应温度；3）建立巢式PCR内侧引物扩增反应温度：4）扩增产物分析。能快速、准确地将被检土壤样品中的H9亚型禽流感病毒检测出来，同时适用于动物H9亚型禽流感病毒感染的检测以及环境中H9亚型禽流感病毒的监测。

主权项

1.一种土壤中H9亚型禽流感病毒分子的检测方法，其步骤是：（1）根据报道的登录号为JN381629的H9亚型禽流感病毒HA基因序列设计引物对，所述的引物对的核苷酸序列如下：外引物-F:5'-CTATCCAAGACGCCCAATACAC-3'；外引物-R:5'-CAACCAGCGACTAGCCTTGA-3'；内引物-F:5'-AAATACCACATTGCCATTCCAC-3'；内引物-R:5'-AGCCTTGACCAACCTCCCTC-3'；（2）待检土壤样品的处理：将同一地点不同位置所采的土壤混合，过20目分析筛，去除土壤中的石头及杂草；（3）待检土壤样品中RNA的提取：使用土壤RNA提取试剂盒，提取土壤中的总RNA，其步骤如下：a、称取1gGlassBeadsI和1gGlassBeadsII在15mL离心管中，添加2.5g土壤样品；b、加入2mLBufferSRX至管中，涡旋1min混匀样品；c、加入200μLBufferDS至管中，涡旋30s混合样品；d、添加1mL水饱和酚和1mL氯仿，速度涡旋10min，4℃，4,000×g离心10min；e、取上层水相到新的15mL离心管；f、加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，-20℃孵育10min；g、4℃，4000×g，离心20min；h、去除上清，颠倒离心管放在吸水纸上干燥5min；j、加入100μlDEPC水，并在室温下静置10min，震荡混合样品2次；K、加入0.9mLRNA-SolvReagent和0.2mL氯仿，涡旋15s；L、4℃，10,000×g，离心10min；M、取上层水相至新的2mL收集管中；N、添加等体积70%V/V的乙醇混合，涡旋15s；P、从第N步提取750μl样品到HiBindRNAColumn，插入一个2mL收集管；Q、10,000×g，离心30s，弃掉液体；R、将HiBindRNAColumn放入上一步的收集管，并从N步开始加入剩余的样品；S、10,000×g，离心30s，弃液体和收集管；T、将HiBindRNAColumn放入新的2mL收集管，加入500μL的RNAWashBuffer到HiBindRNAColumn，10,000×g，离心30s，弃液体和重复使用收集管；W、将HiBindRNAColumn放入上一步收集管，加入750μlRNAWashBufferII到HiBindRNAColumn，10,000×g，离心30s，弃流通液体，并重新使用收集管；X、将HiBindRNAColumn放入上一步收集管，并空离2分钟，转速>10,000×g；Y、放置HiBindRNAColumn到新的1.5mL的离心管上，加入50μlDEPC处理水到HiBindRNAColumn膜的中心，室温静置1min；Z、速度>14000×g离心1min，洗脱RNA；（4）病毒RNA的反转录，建立病毒RNA反转录体系：①RNA模板3μL，引物U122μmol/L1μL，dNTP混合液各2.5mmol/L1μL，加DEPC水至10μL，反应温度：65℃5min，4℃2min；②5×PrimeScriptBuffer4μL,RNase抑制剂0.5μL,PrimeScriptReverseTranscriptase200U/μL1μL,加DEPC水至20μL，反应温度：45℃30min，70℃15min；（5）巢式PCR扩增目的基因：1）建立巢式PCR扩增反应体系：第一轮PCR反应体系：2.5μL10×TapDNA聚合酶缓冲液，dNTP混合液各2.5mmol/L1μL，0.5μmol/L的外引物，0.2U的rTapDNA聚合酶，3μLcDNA模板，灭菌双蒸水补齐至25μL；第二轮PCR反应体系：2.5μL10×TapDNA聚合酶缓冲液，dNTP混合液各2.5mmol/L1μL，0.5μmol/L的内引物，0.2U的rTapDNA聚合酶，3μLDNA模板，灭菌双蒸水补齐至25μL，其中阳性对照为土壤中提取的H9亚型禽流感病毒总RNA反转录后的cDNA，阴性对照为灭菌双蒸水；2）建立巢式PCR扩增反应温度：第一轮PCR反应温度：95℃5min；95℃20s,58℃30s,72℃30s,35个循环；72℃5min；第二轮PCR反应温度：95℃5min；95℃20s,61℃30s,72℃20s,35个循环；72℃5min；3）扩增产物分析：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，琼脂糖凝胶电泳：取25μL的巢式PCR扩增的最终反应产物6μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭染料的1.5%W/V的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察结果。