[发明专利]嗜酸性喜温硫杆菌的基因无痕敲除和整合方法

摘要

本发明公开了一种无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入染色体的方法，是将含有大范围核酸内切酶I-SceI酶切位点的同源重组质粒采用接合转移的方式转入喜温硫杆菌中，同时利用细胞自身的同源重组系统，将同源重组质粒定向插入到喜温硫杆菌染色体中，筛选到的单交换子用电转化法转入I-SceI表达质粒，在I-SceI酶切断染色体的压力下，单交换子染色体发生第二次同源重组，优化筛选到双交换菌株，实现了基因的敲除或插入。本发明同时构建了用于同源重组的自杀型质粒载体pSDUDI，和有效表达I-SceI酶的质粒pSDU1-I-SceI，为喜温硫杆菌中染色体基因的无痕敲除或整合提供了便利。本发明方法为喜温硫杆菌的深入研究和改造提供了新的途径。

主权项

一种无痕敲除嗜酸性喜温硫杆菌染色体基因或将外源基因插入嗜酸性喜温硫杆菌染色体的方法，步骤包括构建同源重组的自杀型质粒载体，在载体的多克隆位点处插入同源臂得到同源重组质粒，将构建的同源重组质粒通过化学转化法转入大肠杆菌SM10菌株，通过接合转移法将同源重组质粒从E.coli SM10菌转入嗜酸性喜温硫杆菌中，平板筛选单交换子并进一步鉴定，构建大范围核酸内切酶I‑SceI的表达质粒并用电转化法转入单交换子中，平板筛选双交换子并进一步鉴定；其中：所述自杀型质粒载体是pSDUDI，质粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述同源重组质粒是pSDUDI‑ΔsoxYZ，将其从E.coli SM10菌转入嗜酸性喜温硫杆菌中的方法是：将收集到的E.coli SM10和嗜酸性喜温硫杆菌菌液按照1∶3的比例混合后，取50ul滴到接合平板上的滤菌膜上，37℃放置48h后，用5mL洗涤液洗涤滤膜，得到的细胞悬液梯度稀释后涂布加入卡那霉素的Starky‑Na2S2O3固体培养基上，37℃，培养7～10天；所述平板筛选单交换子并进一步鉴定的方法是：挑取筛选平板上的菌落，溶于无菌水中，取菌液为模板，使用引物oriT EcoR sen和oriT Sal ant特异性扩增自杀型质粒载体上接合转移基因oriT，并以野生型菌株染色体为模板作为阴性对照，以质粒pSDUDI‑ΔsoxYZ为模板作为阳性对照，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，正对照所在的泳道会产生740bp的PCR产物条带；负对照在相应的区域则无PCR产物条带；挑取的验证样品中，若在相应区域产生与正对照相似的条带，为单交换子，若无条带产生与负对照相似，为假阳性；对单交换子进一步鉴定方法是：提取单交换子染色体，在被敲除基因的同源臂外侧设计引物2520YANZH sen和2520YANZH ant用PCR扩增，并以野生型菌株染色体为阴性对照，如果琼脂糖凝胶电泳检测显示以单交换子染色体为模板PCR扩增得到的条带比阴性对照大7～8Kb，则进一步确定是单交换子，若无，则为假阳性；上述引物序列是：oriT EcoR sen：ATTCCGGAATTCGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGoriT Sal ant：TCACGCGTCGACCGGGATTCAACCCACTCG2520YANZH sen：CCGGGTTCCTGGTAAGTC2520YANZH ant：GCTTACTGGCACTGCGATTA所述大范围核酸内切酶I‑SceI的表达质粒是pSDU1‑I‑SceI，质粒pSDU1‑I‑Sce I的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述表达质粒电转化法转入单交换子中的电转化参数是：电压10,500V/cm；电阻400Ω；电容：25μF；所述平板筛选双交换子方法是：电转化后将菌悬液加入到Starky‑S0液体培养基中，37℃，50～60rpm过夜培养后加入氯霉素，转速提高到100～120r/min再培养36‑60h后，梯度稀释涂布于加入氯霉素的筛选平板上，37℃倒置培养10～15天；在筛选平板上挑取 菌落，在被敲除基因上下游150～250bp处设计引物2520test sen和2520test ant，用菌落PCR扩增，如果琼脂糖凝胶电泳检测显示只在300～500bp处有目的条带，则初步判断是双交换子；上述引物序列是：2520test sen：AAATTGCGGAAAGTCTCG2520test ant：TGGGTATCGGTGATGTGC所述双交换子的进一步鉴定方法是：将筛选到的双交换子菌落培养后提取染色体，在被敲除基因同源臂的外侧设计引物2520YANZH sen和2520YANZH ant PCR扩增验证被敲除基因上下游区域，以双交换子染色体为模板用PCR扩增，并以野生型菌株染色体为阴性对照，如果琼脂糖凝胶电泳检测显示以双交换子染色体为模板扩增得到的产物比阴性对照小，且差值是被敲除基因的大小，则进一步确定是双交换子。