[发明专利]HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法

摘要

HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前杆状病毒介导的外源基因在CHO细胞中的表达率较低的问题。方法：一、以pMD18-T-VP2为模板进行PCR扩增，获得目的片段进行TA克隆及载体连接，得pTZF-HA-VP2；二、九种质粒和pTZF-HA-VP2分别进行双酶切，酶切后的目的片段进行连接，得九种重组转移载体；三、九种重组转移载体分别转化感受态细胞，经提取后得rBac-TZF-X；四、rBac-TZF-X转染sf9细胞，得rBV-TZF-X即完成。本发明添加调控元件WPRE可以提高杆状病毒介导外源基因在CHO细胞中的表达率。

主权项

HA‑VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于HA‑VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：一、以质粒pMD18‑T‑VP2为模板，TZF‑1和TZF‑2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与pMD18‑T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒pTZF‑HA‑VP2；二、质粒pWK、pWK‑I、pLM、pLM‑I、pSD、pSD‑I、pWKC、pLMC、pSDC和pTZF‑HA‑VP2分别进行EcoR I/Sal I双酶切，酶切后获得的目的片段pWK、pWK‑I、pLM、pLM‑I、pSD、pSD‑I、pWKC、pLMC、pSDC分别与酶切后的pTZF‑HA‑VP2用T4DNA连接酶进行连接，九种连接产物经鉴定后获得九种重组转移载体，分别为pTZF‑WK‑HA‑VP2、pTZF‑WK‑I‑HA‑VP2、pTZF‑LM‑HA‑VP2、pTZF‑LM‑I‑HA‑VP2、pTZF‑SD‑HA‑VP2、pTZF‑SD‑I‑HA‑VP2、pTZF‑WKC‑HA‑VP2、pTZF‑LMC‑HA‑VP2和pTZF‑SDC‑HA‑VP2；三、将九种重组转移载体分别转化E.coli DH10 Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒rBac‑TZF‑X；四、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒rBac‑TZF‑X转染sf9细胞，获得九种重组杆状病毒rBV‑TZF‑X，分别为rBV‑TZF‑WK‑HVP2、rBV‑TZF‑WK‑I‑HVP2、rBV‑TZF‑LM‑HVP2、rBV‑TZF‑LM‑I‑HVP2、rBV‑TZF‑SD‑HVP2、rBV‑TZF‑SD‑I‑HVP2、rBV‑TZF‑WKC‑HVP2、rBV‑TZF‑LMC‑HVP2和rBV‑TZF‑SDC‑HVP2，即完成HA‑VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建；其中步骤一中引物TZF‑1序列为5’‑CCGGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC‑3’；引物TZF‑2序列为5’CGCGTCGACTTACCTTATGGCCCGGATTATGTCTTT‑3’。