[发明专利]一种采用多手段提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法

摘要

本发明公开了一种采用多手段提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法，利用PVP预洗涤去除腐殖酸，CTAB、溶菌酶、蛋白酶和SDS共同作用以裂解细胞的同时对其反复冻融，获得了良好的细胞裂解效果，利用PEG8000沉淀DNA，获得的DNA纯度高。所用方法简单方便，不经纯化即可用于后续的PCR分析和DGGE分析。提取的DNA纯度达到直接进行后续分子生物学研究的需要，提取的DNA片段可进行16SrDNA的扩增及DGGE图谱分析，并可对DGGE谱带的特异条带切胶回收、碱基测序，与RDP数据库中已有的序列进行比对，或通过建立新的序列探针识别未知菌，从而确定微生物群落结构组成，为今后研究桑树根围土壤微生物群落结构多样性与生态功能奠定基础。

主权项

一种采用多手段提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：所述的方法具体为PVP预处理‑CTAB、CaCl2、BSA‑溶菌酶‑蛋白酶‑SDS‑反复冻融法，取5g土样加入20g/L偏磷酸钠缓冲液30mL，摇床振荡15min，8500r/min离心5min，取沉淀，重复洗涤3次；取沉淀，加入13.5mL DNA提取液II和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min；加入100mg/mL溶菌酶150μL，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；再加入20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃水浴1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，在上清液中加入0.5倍体积25％PEG 8000和0.1倍体积5mol/L NaCl，4℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μL TE溶解沉淀，‑20℃保存；即获得桑树根围土壤微生物总DNA。所述DNA提取液II成分为Tris‑HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L，Na3PO4100mmol/L，NaCl 1.5mol/L，1％CTAB，2％CaCl2，1μg/mL BSA；pH 8.0。所述的土样，采自桑树根围土壤，深度为5～10cm表土层，按5点法取样，混匀后放入无菌袋中，4℃保存。