[发明专利]一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法

摘要

本发明公开了一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法。将兜唇石斛母株通过人工异交授粉后得到成熟的种子，把种子放入特制的种子袋中，将种子袋放置在有兜唇石斛植株生长的原生地，在自然条件下诱导种子萌发产生原球茎；将获得的原球茎表面灭菌后在无菌条件下用人工培养基培养，诱导原球茎中的内生真菌生长，待长出菌丝时，进行真菌的纯化，获得纯菌落；将获得的真菌和兜唇石斛的种子进行共生萌发培养，设置对照实验，以检验所获得的真菌对兜唇石斛的种子萌发的有效性，筛选出兜唇石斛种子萌发的有效共生真菌，并进行真菌的分子鉴定和保存。本发明为利用兜唇石斛种子和真菌共生萌发来培育种苗开辟了一条新的途径。

主权项

一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，包括以下步骤：(1)在兜唇石斛花期进行人工异交授粉，果实成熟但果荚尚未裂开时收获果实，将种子干燥后置于无菌的密闭玻璃容器中在‑20℃条件下保存，待用；(2)用灭菌的镊子将100～200粒兜唇石斛的种子播种在尼龙网布上，将播好种子的尼龙网布对折，用热封机将三边封起来，制作完成种子袋，在种子袋边缘缝上标签，便于监测和回收；(3)选择有兜唇石斛成年植株自然生长的不同地点，将种子袋固定放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的树干上，在种子袋上面覆盖一层苔藓保湿；(4)每个月定期从各放置点回收2～3个种子袋，检查种子袋内种子的萌发情况，当发现有原球茎时，回收所有的种子袋；(5)将回收的原球茎依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗后切成两半，切口面贴于马铃薯葡萄糖培养基PDA上进行培养；(6)原球茎切口处长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的PDA培养基上，转移3～5次后，得到纯菌落；(7)将兜唇石斛的种子放入无菌水中制成均匀的悬浮液，在配制好的燕麦琼脂培养基的培养皿表面放置两张无菌滤纸，分别吸取150微升的种子悬浮液均匀地散布在两张滤纸条上；在培养基中心接种含有不同来源的单一共生真菌纯培养物的琼脂块，同时设置不接菌的对照处理组，每个处理10个重复，用封口膜密封后置于人工气候箱中培养；(8)每周观察1次不同处理的种子，记录种子萌发数量及萌发时间，对种子萌发和原球茎发育情况进行分级，记录每一阶段内种子或原球茎的数量，通过和不接菌处理组的对比，筛选出兜唇石斛种子萌发的有效共生真菌。