[发明专利]一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法

摘要

本发明涉及一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，由于通过驱动电路驱动聚合物分散液晶同轴透镜阵列，来控制焦点的位置，从而实现斩波，通过控制施加在不同液晶盒上的电压，可以达到单点控制的效果，同时还具有横向分辨率、纵向分辨率、时间分辨率高等特点，由于控制的是N×N式透镜阵列，可以实现多点并行实时探测。在荧光共焦探测和生物方面有诸多应用，如可对活体细胞进行实时观测，获取活细胞内的信息，并对所获得的信息进行定量分析，比目前一般的共焦显微探测系统更加便捷、高效。

主权项

一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1）搭建N×N通道多频调制激光光路：将激光器（1）、扩束镜（2）、同轴H‑PDLC透镜阵列（3）、滤波板（4）、透镜（5）同轴依次搭建，并与平台始终保持水平， 30mw准直半导体激光器（1） 发出的波长为405nm的光束耦合进扩束镜（2），扩束镜（2）出射的光束到达N×N式同轴H‑PDLC透镜阵列（3）上进行分光和不同频率的斩波调制，使得通过N×N式同轴H‑PDLC透镜阵列（3）上的液晶盒阵列的激光的焦点处在滤波板（4）上的小孔位置；2）搭建N×N路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发光路：通过焦平面也在同轴H‑PDLC透镜阵列（3）的焦平面F的透镜（5），将经H‑PDLC透镜阵列（3）出射的聚焦的N×N束光调整为平行光束射出，耦合进入二向色镜组（6）中，经二向色镜组（6）激发的405nm的激光将耦合射入到放大倍率为40倍、数值孔径为0.65的无限远油浸显微物镜（7），将生物样品（8）摆放于三维调整架之上，调整三维调整架使生物样品（8）恰好处于显微物镜（7）焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品（8）上聚焦为n2个光点，激发出荧光；3）搭建n2路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像：由生物样品（8）表面激发的520nm‑540nm绿色荧光在样品与显微物镜（7）相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜（7），成为平行光束，入射到二向色镜组（6）上，荧光全部从二向色镜组（6）透射出去，透射出的荧光入射分光棱镜（9）进行第二次分光，分成两部分，其中一部分由消色差透镜（10）会聚聚到 CCD摄像机（11）由CCD采集样品的信号最后在计算机中软件中得到样品细胞图像，另一部分荧光经一透镜（12）由光纤耦合器阵列（13）耦合并通过光纤（14）输送到光电倍增管PMT(15)中，该信号属于共焦扫描显微信号；4）信号采集与处理部分的实现：光电倍增管PMT(15)将根据生物样品中激发得到的n2个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出，将光电倍增管的输出端接电压放大电路（16），电压放大电路（16）将PMT(15)采集到的微弱信号进行电压放大，接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机（17），计算机（17）通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。