[发明专利]一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法

摘要

本发明公开了一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，包括下述步骤：(1)预培养；(2)菌种活化与培养；(3)侵染；(4)共培养；(5)延迟选择；(6)诱导不定芽；(7)伸长培养；(8)诱导生根及检测。本发明提供的方法，NAA和2ip联合作用诱导经农杆菌介导的茎段或叶柄产生愈伤组织，在细胞分裂素TDZ作用下，促使愈伤再分化形成不定芽，呈玻璃化状态的幼芽在BAP诱导下伸长，形态逐渐趋于正常，具有抗性的再生杨树在含有抗生素潮霉素的1/2MS培养基中生根。本方法获得的抗性转基因杨树，周期短，转化效率高，为转基因杨树在实践中的育种提供了坚实的基础和理论支持。

主权项

一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征包括下述步骤：(1)预培养：将717杨树腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4‑6周获得组培苗；切取所述组培苗0.8‑1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2‑3次造成伤口或切取所述组培苗的带有0.1‑0.5cm2叶片的叶柄置于M1′培养基中，于24‑26℃黑暗条件下预培养2‑3天；(2)菌种活化与培养：用移液枪枪头挑取‑80℃保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27‑29℃倒置暗培养20‑28h；挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27‑29℃倒置暗培养36‑48h；挑取单菌落至含有抗生素的2‑4mLYEB液体培养基的无菌试管中，150‑200rpm 27‑29℃暗培养12‑16h；吸取0.1‑1.0mL菌液至含有抗生素的50‑75mLYEB液体培养基的锥形瓶中，150‑200rpm 27‑29℃暗培养至OD600＝0.6‑0.8；(3)侵染：将步骤(2)获得的菌液在室温、3500‑4000rpm离心10‑15min，弃去上清液，将沉淀用50‑75mL M液重悬，24‑26℃，80‑100rpm活化0.5‑1h得到侵染液；按30‑50个：25mL的比例将经步骤(1)预培养的茎段或带有叶片的叶柄放入所述侵染液中，24‑26℃条件下80‑100rpm侵染30‑60min；(4)共培养：从侵染液中取出茎段或带有叶片的叶柄，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放在M1固体培养基上，24‑26℃，暗条件下共培养2‑3天；(5)延迟选择：取出步骤(4)共培养的茎段或带有叶片的叶柄，先用去离子水在180‑220rpm下洗涤4‑5min，洗涤2‑3次，接着用浓度为350‑500mg/L的头孢霉素‑去离子水溶液洗涤4‑5min，洗涤2‑3次，用无菌滤纸上吸干表面水分并转移至CIM延迟选择培养基中，24‑26℃暗培养10‑11天，取出更换至新的CIM延迟选择培养基上继续24‑26℃暗培养10‑11天，得到带有愈伤组织的茎段或叶柄；(6)诱导不定芽：将所述带有愈伤组织的茎段或叶柄转移至SIMa筛选培养基中，光照条件下进行培养，每15‑20天更换一次培养基；待长出绿色愈伤组织0.2‑0.5cm2，取出绿色愈伤组织至新鲜SIMa筛选培养基中培养，待绿色愈伤组织表面开始长出不定芽；将带有不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb筛选培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至1‑2cm；(7)伸长培养：切割留有少量愈伤组织的呈玻璃化状态的不定芽，转移至含有SEM筛选培养基的组培瓶 中进行伸长培养，培养2‑4周，获得表型趋于正常的芽；(8)诱导生根及检测：取步骤(7)获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM培养基中，诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。