[发明专利]猪鼻支原体巢式PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、耳炎等的猪鼻支原体的巢式PCR检测方法，主要步骤包括：1）提取猪鼻支原体样品的DNA，低温保存备用；2）以一对特异性引物MhrP01、MhrP02对猪鼻支原体样品进行第一轮PCR扩增；3）以另一对特异性引物MhrP03、MhrP04对猪鼻支原体第一轮PCR产物进行第二轮PCR扩增；4）对扩增产物进行电泳检测。如果存在346bp的特异性条带，则确定所检测的病菌为猪鼻支原体。本方法在微量病原菌的存在下，都可以准确检出，只要有102CCU/mL病原菌存在，即可检测出。本发明的优点是检测速度快、特异性强、灵敏度高和易于推广。

主权项

一种猪鼻支原体的巢式PCR检测方法，其特征在于包括下列步骤：1）提取猪鼻支原体样品的DNA，低温保存备用；2）以一对特异性引物Mhr P01、Mhr P02对猪鼻支原体样品进行第一轮 PCR扩增；其中：上游引物 Mhr P01的序列为：5’‑GCATCTATATTTTCGCCAATAGC‑3’；下游引物 Mhr P02的序列为：5’‑AGCTAGAGTTTCATCATTACC‑3’；所述第一轮 PCR扩增方法是：在PCR试剂管Ⅰ中的反应液总体积为20μl，包括：待测样品猪鼻支原体DNA模板提取液0.5~1.0μl， 10×PCR Buffer(Mg2+ Free) 1.0~2.5 μl， 25mM MgCl2 1.0~2.0μl，2.5mM dNTPs 1.0~3.0 μl，10pmol/μl上游引物Mhr P01 0.5~1.0μl，10pmol/μl下游引物Mhr P02 0.5~1.0μl， 5单位/μl TaqDNA聚合酶0.2~0.5μl，灭菌超纯水补至总体积20μl，3000~5000g离心2~5秒钟混匀，置于PCR仪内扩增反应；反应条件为：通过94~96℃ 解链2~5分钟，然后94~96℃变性40~60秒，50~56℃复性60秒，72℃延伸40~90秒，25~35个循环，最后72℃延伸6~10分钟，得猪鼻支原体第一轮PCR产物；3）以另一对特异性引物Mhr P03、Mhr P04对猪鼻支原体第一轮PCR产物进行第二轮PCR扩增；其中：上游引物 Mhr P03的序列为：5’‑GTAGTCAAGCAAGAGGATGT‑3’；下游引物 Mhr P04的序列为：5’‑GCTGGAGTTATTATACCAGGA‑3’；所述第二轮PCR扩增方法是：在PCR试剂管Ⅱ中加入猪鼻支原体第一轮PCR产物进行反应，其反应液总体积为20μl，包括：猪鼻支原体第一轮PCR产物0.5~.1.0μl， 10×PCR Buffer(Mg2+ Free) 1.0~2.5 μl， 25mM MgCl2 1.0~2.0μl，2.5mM dNTPs 1.0~3.0 μl，10pmol/μl上游引物Mhr P03 0.5~1.0μl，10pmol/μl下游引物Mhr P04 0.5~1.0μl， 5单位/μl TaqDNA聚合酶0.2~0.5μl，灭菌超纯水补至总体积20μl，3000~5000g离心2~5秒钟混匀，置于PCR仪内扩增反应；反应条件为：通过94~96℃解链2~5分钟，然后94~96℃变性40~60秒，46~50℃复性60秒，72℃延伸60~90秒，25~30个循环，最后72℃延伸6~10分钟，得猪鼻支原体第二轮PCR产物； 4）电泳检测取猪鼻支原体第二轮PCR产物5~10μl，与2~6μl 0.25%（质量/体积）溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.8~2%（质量/体积）Goldview的0.7~1%（质量/体积）琼脂糖凝胶在电压80~100V下电泳20~30分钟，于凝胶成像系统中透射紫外灯下拍照检测，样品孔有一条346bp的核酸条带为有猪鼻支原体感染或污染的阳性样品，即可确定待测样品中含有病原菌猪鼻支原体，反之则没有。