[发明专利]一种胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法

摘要

本发明公开了一种胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，包括：取待保存的胚性材料接种入高渗液体培养基，25℃培养3~10d；过滤胚性材料装入冷冻管，加入复合玻璃化保护剂，0℃脱水0～70min，然后装入冷冻盒直接投入液氮速冻，液氮中长期保存；取保存的材料依次经过洗涤、高渗培养、低渗培养、常规培养即可复苏。本发明的胚性材料的超低温冷冻保存方法，操作简单，方便可行，解决了林木体胚产业化的重要瓶颈问题，可实现胚性材料长期保存到1年以上，并能使其保持高频增殖能力，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。

主权项

一种胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取待保存的胚性材料，按10%的接种量接入高渗液体培养基，25℃，培养3~10d；其中，高渗液体培养基为添加有0.1~0.8mg/L山梨醇的M13基本培养基；（2）过滤步骤（1）预培养的胚性材料，装入冷冻管，向冷冻管中加入复合玻璃化保护剂，0℃，放置脱水0～70min，然后装入冷冻盒直接投入液氮速冻，液氮中长期保存；复合玻璃化保护剂为添加30%甘油和30%乙二醇的M13基本培养基；（3）从液氮中取出冷冻盒，迅速将冷冻管置于35~43℃水浴中，快速化冻2min；吸去复合玻璃化保护剂，向冷冻管加入1mL的高渗愈伤增殖培养基，停留2min，数次重复洗涤；高渗愈伤增殖培养基为添加0.1~0.5M蔗糖的M13基本培养基；（4）把洗涤后的胚性材料迅速转移到垫有滤纸的高渗愈伤增殖培养基，25℃，培养1~6d； （5）转胚性材料至低渗愈伤增殖培养基上培养1~6d，长出新的愈伤组织，然后转移到愈伤增殖培养基上进行培养；低渗愈伤增殖培养基为添加0.1~0.4M蔗糖的M13基本培养基；（6）转移长有新的愈伤组织的胚性材料至体胚诱导培养基上培养，直至高频体细胞胚胎发生即可。