[发明专利]Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体及其表达纯化方法

摘要

一种Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，N-端为Ⅰ型人胶原蛋白编码序列，C-端为人表皮生长因子编码序列，两段肽段之间用α信号肽切割位点Lys-Arg-Glu-Ala连接，建立人表皮生长因子和胶原蛋白双表达体系。表达纯化方法包括基因的获得、载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子的连接、毕赤酵母电转化、多拷贝插入重组子的筛选、Ⅰ型人胶原蛋白-表皮生长因子的发酵表达、Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子的纯化步骤。本发明利用胶原蛋白在毕赤酵母的高表达特性，引导融合人表皮生长因子的高表达，在蛋白酶作用下，切割成两个独立的单体蛋白，通过纯化，获得基因重组人表皮生长因子及Ⅰ型人胶原蛋白。

主权项

一种Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，其特征在于：插入的外源序列氮端为Ⅰ型人胶原蛋白的600个氨基酸，碳端为表皮生长因子的53个氨基酸，在Ⅰ型人胶原蛋白上游添加pPIC9K载体自身α信号肽切割位点和用于连接载体的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生长因子上游添加pPIC9K载体自身α信号肽切割位点以及用于连接Ⅰ型人胶原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，该Ⅰ型人胶原蛋白‑表皮生长因子的氨基酸序列如下：1        LEKREAGVAG PKGPAGERGS PGPAGPKGSP GEAGRPGEAG LPGAKGLTGS PGSPGPDGKT61       GPPGPAGQDG RPGPPGPPGA RGQAGVMGFP GPKGAAGEPG KAGERGVPGP PGAVGPAGKD121      GEAGAQGPPG PAGPAGERGE QGPAGSPGFQ GLPGPAGPPG EAGKPGEQGV PGDLGAPGPS181      GARGERGFPG ERGVQGPPGP AGPRGANGAP GNDGAKGDAG APGAPGSQGA PGLQGMPGER241      GAAGLPGPKG DRGDAGPKGA DGSPGKDGVR GLTGPIGPPG PAGAPGDKGE SGPSGPAGPT301      GARGAPGDRG EPGPPGPAGF AGPPGADGQP GAKGEPGDAG AKGDAGPPGP AGPAGPPGPI361      GNVGAPGAKG ARGSAGPPGA TGFPGAAGRV GPPGPSGNAG PPGPPGPAGK EGGKGPRGET421      GPAGRPGEVG PPGPPGPAGE KGSPGADGPA GAPGTPGPQG IAGQRGVVGL PGQRGERGFP481      GLPGPSGEPG KQGPSGASGE RGPPGPMGPP GLAGPPGESG REGAPGAEGS PGRDGSPGAK541      GDRGETGPAG PPGAPGAPGA PGPVGPAGKS GDRGETGPAG PAGPVGPVGA RGPAGPQGPR601      GDKGETEFKR EANSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK YACNCVVGYI GERCQYRDLK661      WWELR