[发明专利]提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法

摘要

提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，涉及一种提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法。本发明是要解决现有大豆根瘤菌基因工程菌株在接种到大豆幼苗后，与原始出发菌株相比，大豆植株所结根瘤数及大豆产量增幅小的问题。方法：对费氏中华根瘤菌进行活化和扩培，提取基因组DNA；采用同源序列克隆法，PCR扩增，获得目的基因dctA；对目的基因进行测序鉴定；构建重组载体pET-Plac-dctA；然后构建原核生物表达载体pTR-Plac-dctA；六、将原核生物表达载体转化到费氏中华根瘤菌中，即获得基因工程菌株。转化本发明基因工程菌株的大豆植株所结根瘤数增加53.73％，大豆产量增加62.02％。

主权项

提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：一、对费氏中华根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取费氏中华根瘤菌15067的基因组DNA；二、采用同源序列克隆法，以费氏中华根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因dctA；三、对目的基因dctA进行测序鉴定；四、将目的基因dctA与重组质粒载体pET‑Plac分别经NdeI和BamHI进行双酶切，将酶切后的目的基因dctA和酶切后的载体pET‑Plac连接，获得重组载体pET‑Plac‑dctA；五、以重组载体pET‑Plac‑dctA为模板进行PCR扩增，构建Plac‑dctA‑T7片段，然后将Plac‑dctA‑T7片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，将酶切后的Plac‑dctA‑T7片段和酶切后的pTR102质粒载体连接，构建原核生物表达载体pTR‑Plac‑dctA；六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR‑Plac‑dctA转化到费氏中华根瘤菌15067中，即获得基因工程菌株HD‑SF‑04；其中步骤二中PCR扩增所用上游引物P1为5′‑CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC‑3′，下游引物P2为5′‑GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC‑3′；步骤五中PCR扩增所用上游引物P3为5′‑CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG‑3′，下游引物P4为5′‑CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA‑3′。