[发明专利]分析VC生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法

摘要

本发明公开了一种分析维生素C生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法，步骤：（1）混菌传代培养；（2）胞内小分子代谢物样品的制备和测定；（3）主成分分析；（4）过程分析：将小分子代谢物标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析小分子代谢物标志物变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中细胞内小分子代谢物的变化。本发明的方法通过对不同传代时间的巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌以及混菌的小分子代谢物分别进行定性和定量分析，找到与增强维生素C生产菌株两菌相互作用相关的代谢物分子和代谢途径，为提高2–酮基–L–古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向，为优化发酵过程，提高维生素C产量奠定基础。

主权项

一种分析维生素C生产菌株传代过程中小分子代谢物变化的方法，其特征是包括如下步骤：（1）混菌传代培养：①固体培养：取保藏于体积浓度为15‑30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）和保藏于体积浓度为15‑30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28‑35℃，培养24‑48h；②种子培养：将经步骤（1）①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28‑35℃，200‑280rpm摇床振荡培养24‑48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×107‑2×1010CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×108‑2×1011CFU/mL，在28‑35℃，200‑280rpm摇床振荡培养，以24‑48h为传代周期，以体积比为1%‑10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100‑150天得到混菌细胞，在传代0‑100天或0‑150天中选定3‑4个时间取样，取3‑4个样；③分纯：将步骤（1）②获得的3–5个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28‑35℃培养24‑48h；再分别转入新的种子培养基，在28‑35℃，200‑280rpm摇床振荡培养24‑48h，分别得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15‑30%的甘油水溶液中；④发酵：将步骤（1）③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×107‑2×1010CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108‑2×1011CFU/mL，在28‑35℃，200‑280rpm摇床振荡培养10‑15h；（2）胞内小分子代谢物样品的制备和测定：①各取在步骤（1）④获得的三种细胞悬液100‑200mL，分别在1000‑3000rpm离心3–10min，去除上清液，保留细胞，用pH=7.2‑7.4的磷酸盐缓冲液洗细胞1‑3次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；②将步骤（2）①所得细胞制成干粉，各称取30‑60mg细胞干粉，分别置于三个离心管中，再加入0.5–1.5mL提取液，加入30‑70μL浓度为0.020‑0.060mg/mL氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，混匀；1000–3000rpm离心3–10min，取上清液置于三个新的离心管中冷冻干燥；③将步骤（2）②获得三个离心管中分别加入40‑100μL浓度为10‑30mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30℃‑40℃水浴中肟化反应60‑120min；再加入50‑100μLN‑甲基‑N‑三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃‑40℃水浴进行硅烷化反应30‑60min；所述提取液为体积分数为50‑70%的甲醇水溶液；④GC‑TOF/MS检测：将1μL步骤（2）③获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB‑5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度为250℃‑280℃，载气为高纯氦气，恒压80‑100KPa，分流比3：1‑20：1，柱温箱升温程序为：初始50℃‑80℃，保持3min‑6min，以4℃/min‑8℃/min的升到260℃‑300℃，保持3min‑8min，使用EI电离源，源温230℃‑260℃，检测器电压2300V‑2700V，电离电压60eV‑80eV，电流30μA‑50μA；质谱检测范围50‑800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到小分子代谢物的相对含量；（3）主成分分析：①将步骤（2）④获得的维生素C生产菌株传代过程的小分子代谢物的相对含量数据进行Pareto预处理；②用SIMCA‑P 11.5软件对预处理后的数据进行主成分分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的小分子代谢物标志物；（4）过程分析将小分子代谢物标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析小分子代谢物标志物变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中细胞内小分子代谢物的变化。