[发明专利]一种通过微卫星标记检测陶赛特羊早期生长发育的方法

摘要

本发明提供的一种通过微卫星标记检测陶赛特羊早期生长发育的方法，包括1）依据第五代绵羊基因图谱，发现位于绵羊18号染色体末端93.9cM位置的微卫星标记UMP；2）人工合成一对核苷酸序列作为检测微卫星标记UMP基因型的引物，其正向引物：5'-CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT-3'；反向引物：5'-GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT-3'；上下游引物长度分别为24bp和23bp；3）采集陶赛特羊血液，提取基因组DNA，利用引物扩增PCR，以凝胶成像确定已扩增的目的条带；4）利用荧光标记的PCR引物对多态位点进行扩增并确定扩增片段的长度，实现对微卫星多态位点的分型，确定陶赛特羊微卫星标记UMP的基因型分别是104/110，107/110，104/107，110/110，104/104，107/107。检测确定微卫星标记UMP不同基因型个体间的生长发育差别，用于辅助选择育种。

主权项

一种通过微卫星标记检测陶赛特羊早期生长发育的方法,其特征在于：包括1）依据第五代绵羊基因图谱，发现位于绵羊18号染色体末端93.9cM位置的微卫星标记UMP；2）人工合成一对核苷酸序列作为检测微卫星标记UMP基因型的引物，其正向引物： 5'‑ CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT ‑3'；反向引物： 5'‑ GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT ‑3'；上下游引物长度分别为24bp和23bp；3）采集陶赛特羊血液，提取基因组DNA，利用引物扩增PCR，以凝胶成像确定已扩增的目的条带；4）利用荧光标记的PCR引物对多态位点进行扩增并确定扩增片段的长度，实现对微卫星多态位点的分型，确定陶赛特羊微卫星标记UMP的基因型分别是104/110，107/110，104/107，110/110，104/104，107/107；其中绵羊基因组DNA体外扩增：采集羊外周血液1.5ml，使用肝素纳抗凝采血管， ‑20℃冷冻保存，提取基因组DNA；其中绵羊血液基因组DNA的制备：（1）取出‑20℃冷冻血液0.5‑1.0 ml，在室温下完全融化，于10000 r/min离心10分钟，弃去上层液，中含裂解的红细胞；加入1ml红细胞裂解液，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀10 分钟，于10000 r/min 离心10分钟，弃去上层液；再加入1ml红细胞裂解液，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀10 分钟，于10000 r/min 离心10分钟，弃去上层液；（2）向管内依次加入600μl的白细胞裂解液，70ul的10% SDS溶液 ，15ul浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液和3 ul浓度为10mg/mL 的Rnase A溶液，弹起管底沉淀，轻柔的摇匀，置于55℃振荡水浴锅中振荡过夜；（3）取出混合液将其冷却至室温，向管内加入600ul Tris‑HCl饱和酚溶液，将两相上下轻柔颠倒混匀5分钟，于10000 r/min 离心10分钟；用直径为0.2‑0.35cm的1ml枪头将上层清液吸出600ul‑650ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入酚：氯仿比1:1的混合溶液600ul，轻柔的摇匀10 分钟，于10000 r/min 离心10分钟；再用直径为0.25‑0.38cm的1ml枪头将上层清液吸出490‑520ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入氯仿溶液600ul，轻柔的摇匀10 分钟，于10000 r/min 离心10分钟；第三次用直径为0.28‑0.37cm的1ml枪头将上层清液吸出300‑350ul，移至另一新的灭菌离心管中，加入无水乙醇1ml，轻柔的摇匀2 分钟，可看到漂浮的絮状物即为DNA，于10000 r/min 离心10分钟；（4）将管内的上清混合液弃去，加入70%酒精200ul，弹起管底DNA沉淀，于10000 r/min离心5分钟；将管内的上清液弃去，放置于超净工作台上晾干；向管内加入超纯灭菌水50ul，将干燥的DNA弹起混匀，室温或4℃保存直至DNA完全溶解；（5） 用分光光度计来检测基因组DNA的浓度和纯度，提取血样基因组 DNA，其纯度为1.6‑1.8；（6）用0.8%的琼脂糖凝胶,检测提取好的基因组 DNA原液的质量；（7）对每一样品的DNA进行相应倍数的调整，使浓度达到45‑52 ng /uL，作为PCR反应的模版，其余的‑20℃保存备用；   其中PCR扩增反应体系：2.5 μL的 10×PCR buffer，2.0uL 的25mmol/L MgCl，0.5 μL 的10 mmol/L dNTP 混合物，1μL的 10 μmol/L上游引物，1μL 的10 μmol/L下游引物，1.25U 的Taq 酶，1 μ的50ng/μL 绵羊基因组DNA L，无菌去离子水补足25μL；     其中PCR反应循环程序：95 ℃ 5min 1个循环；95℃变性 30s，58℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s共35个循环；72 ℃延伸 6 min 1个循环；    其中微卫星分型标记的检测步骤：（1）将进行PCR反应的96孔板置于冰水混合物上；（2）将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停；（3）使用美国 ABI 公司的3730XL测序列分析仪检测微卫星样本，确定陶赛特羊的微卫星标记UMP基因型，将其不同的基因型作为陶赛特羊早期生长发育速度及特性的分子标记， 用于辅助选择育种；   其中实验液体的配制：红细胞裂解液：将NH4Cl 8.29g，KHCO3 1.0g和EDTA 0.37 g，溶解于800ml去离子水中，定溶至1L，高压灭菌；白细胞裂解液：Tris 1.21g， EDTA 0.7444g，NaCl 23.376g，SDS 10g，加去离子水至1 L，高压灭菌；10% SDS：将SDS 10g，加去离子水至100ml，高压灭菌；1:1的酚：氯仿：取Tris饱和酚与氯仿各100mL混合均匀，棕色瓶中 4℃保存；20mg/mL的蛋白酶K溶液：将100mg蛋白酶K加入5mL无菌双蒸水，终浓度20 mg/mL，分装成小份，‑20 ℃冻存；10mg/mL 的Rnase A溶液：将10mg RNase A加入1mL无菌双蒸水，终浓度10 mg/ml，煮沸10 min后使其自然冷却后使用，‑20 ℃冻存。