[发明专利]利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法

摘要

本发明提供了一种利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法,包括如下具体步骤:选择种细胞；转瓶繁殖细胞传代；收获转瓶中的细胞；细胞接种；生物反应器培养接种细胞；接种禽流感病毒;禽流感病毒繁殖;收集禽流感病毒液；对禽流感病毒细胞液进行灭活;制备禽流感细胞苗；禽流感细胞苗免疫。该方法克服传统工艺生产禽流感疫苗，生产周期长、批间差异大、内毒素含量高、受胚蛋供应的影响，也克服片状载体难于放大的影响。制备的禽流感病毒疫苗产品批间差异小，无细菌污染，产品内毒素含量低，产品甲醛含量也低，质量稳定，生产周期短，易于放大。

主权项

利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法，其特征在于，包括如下具体步骤1：选择导入载体所需要的种细胞MDCK或者Vero；2：转瓶繁殖细胞传代的方法：首先复苏步骤1所选择的种细胞到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照1：4的比例进行传代；然后把4个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞传到1个15L转瓶进行培养；48小时左右按照1：4或1：3的比例进行细胞传代培养；3：收获转瓶中的细胞：将步骤2所得细胞用PBS洗涤2‑3次，然后加入胰酶‑EDTA溶液消化；15L转瓶加入100‑150ml胰酶‑EDTA溶液，其它类型的转瓶按照类似比例添加胰酶‑EDTA溶液消化，然后收集细胞；4：收获的细胞计数后，按照每个微载体添加5‑20个细胞的比例进行细胞接种；每升培养基中加入2‑10克微载体；5：生物反应器培养接种细胞：生物反应器培养细胞的培养基为MEM（Hyclone）；血清使用浓度为7‑10%；CO2通气量为5‑10%；溶氧量为40‑60%的溶液饱和溶氧量；温度为37℃；搅拌速度为30‑55转/分，pH为6.8‑7.4；90‑95%以上的微载体在细胞接种后48‑72h期间能够达到接种禽流感病毒的要求；6：步骤5培养的细胞达到接种禽流感病毒的要求后，接种禽流感病毒，方法如下：6.1）清洗微载体：先沉淀长满细胞的微载体，然后用PBS清洗清洗微载体；6.2）病毒接种：然后加入禽流感病毒‑MEM溶液进行病毒接种，病毒接种过程中培养基的体积为生物反应器工作的体积1/4‑1，病毒接种剂量为0.00001‑1.0MIO，接种过程中不加血清； 6.3）孵育禽流感病毒与细胞：禽流感病毒接种后，向生物反应器中补足生物反应器正常工作所需要的培养基，在禽流感病毒与细胞孵育的过程中，轻轻搅拌微载体使细胞与禽流感病毒充分接触，搅拌速度为30‑45转/分，禽流感病毒与细胞孵育时间为0.5‑10小时；7：禽流感病毒繁殖    病毒繁殖培养基为MEM（Hyclone）； CO2通气量为5‑10%；溶氧量为40‑60%的溶液饱和溶氧量；温度为37℃；搅拌速度为30‑45转/分，pH为6.5‑7.2；病毒繁殖的时间为24‑72h；8：离心收集步骤7所得禽流感病毒液，离心速度为3000‑4500转/分，离心时间为20‑30分钟；9: 灭活步骤8所得禽流感病毒液中的禽流感病毒使用甲醛灭活禽流感病毒，加入的甲醛终浓度为0.01%‑0.2%,灭活的时间为24小时，灭活的温度为15‑37℃；在灭活的过程中进行搅拌使甲醛与病毒混匀；10：然后按照常规方法制备禽流感细胞苗，即按照油相：水相为2：1的体积比例制备疫苗，先把油相进行灭菌处理，然后把步骤9所得完全灭活的禽流感病毒液慢慢倒入搅拌中的油相，乳化制得疫苗； 11：禽流感细胞苗免疫21日龄的SPF鸡，免疫剂量为0.3ml，免疫后14天、21天分别采血进行测定血清中抗禽流感特异性抗体的滴度（HI）。