[发明专利]一种分析微藻磷脂组的方法

摘要

本发明公开了一种分析微藻磷脂组的方法，包括如下步骤：（1）微藻细胞收集及淬灭；（2）提取细胞内磷脂；（3）LC-MS检测。本发明提供了一种分析微藻磷脂组的手段，这种手段涉及细胞代谢反应的终止、磷脂的提取、磷脂的分析，从而获得微藻在不同培养条件下的磷脂的定性和定量结果，为微藻磷脂组的分析提供了方法，这种方法对促进微藻的磷脂研究具有重要的意义。

主权项

一种分析微藻磷脂组的方法，其特征是包括如下步骤：（1）微藻细胞收集及淬灭：取出已培养好的微藻藻液样品3‑5份，每份100‑150mL，在3000‑5000rpm，4℃条件下离心3‑4min，收集下层的细胞，加入3‑5mL代谢终止液，在‑40℃下淬灭5‑10min，在‑80℃下冷冻干燥4‑6h获得冻干细胞；所述代谢终止液为：1500mM NaNO3，36mM CaCl2·2H2O，75mMMgSO4·7H2O和40mM K2HPO4·3H2O，余量为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1:2；（2）提取细胞内磷脂：从3‑5份冻干细胞中各取15‑25mg，分别置于离心管中，每管加入0.75‑1.5mL氯仿及0.3‑0.6mL超纯水，100‑150rpm震荡1‑1.5h；再加入2‑4mL磷脂提取液，室温下以100‑150rpm震荡0.5‑1h，收集氯仿相；向残渣中加入2‑4mL磷脂提取液，室温下以100‑150rpm震荡0.5‑1h，收集氯仿相；反复提取3次，将氯仿相合并，向合并的氯仿相中加入0.5‑1mL 1M KCl水溶液，涡旋0.5‑1min，以3000‑4000rpm离心3‑5min，弃水相，再加入1‑2mL超纯水，涡旋0.5‑1min，以3000‑4000rpm离心3‑5min，弃水相，30‑35℃真空干燥得干物质；溶于磷脂存储液中置于‑40℃保存；所述磷脂提取液为质量百分比为0.05‑0.15%的二丁基羟基甲苯的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液中氯仿的体积百分含量为66.7%；所述磷脂存储液为质量百分比为0.05‑0.15%的二丁基羟基甲苯的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液中氯仿的体积百分含量为50%；（3）LC‑MS检测采用LC‑MS对步骤（2）获得的保存于磷脂存储液中的磷脂样品进行定性和定量处理，条件如下：色谱柱：Venusil XBP硅柱，其规格为150mm×2.1mm i.d.，5μm；进样量：5μL；色谱柱内流速：0.2mL·min‑1；柱温：25°C；流动相配比：流动相A：体积比为89.5/10/0.5的氯仿/甲醇/28%氢氧化铵；流动相B：体积比为55/39/5.5/0.5的氯仿/甲醇/水/28%氢氧化铵；得到磷脂样品中的磷脂谱，所述28%氢氧化铵为质量浓度为28%的氢氧化铵水溶液；流动相线性梯度程序：从开始到第7分钟，流动相A的体积百分比由90%下降到77%；维持77%到第10分钟；从第10分钟到第15分钟，流动相A的体积百分比由77%下降到72%；从第15分钟到第20分钟，流动相A的体积百分比由72%下降到66%；从第20分钟到第25分钟，流动相A的体积百分比从66%下降到60%；从第25分钟到第45分钟，流动相A的体积百分比从60%下降到50%；维持50%到第50分钟；从第50分钟到第60分钟，流动相A的体积百分比从50%上 升到90%；维持90%到第70分钟。