[发明专利]一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法

摘要

一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，涉及毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。是要解决目前绿木霉的植物抗性诱导因子基因表达量低，无法满足其研究与应用的问题。方法：提取棘孢木霉菌丝总RNA，反转录；PCR扩增，纯化扩增产物得目的基因EplT4；目的基因与载体连接构建重组载体；转化，提取阳性转化子质粒，将质粒线性化并回收；转化；将转化细胞涂在上长出重组菌，将重组菌转接到含梯度浓度抗生素的培养基上，在最高浓度抗生素的培养基上生长的菌落即为基因工程菌株Pp-EplT4。本发明方法获得的毕赤酵母基因工程菌株可高效表达棘孢木霉的植物抗性诱导因子基因，表达量为20mg/L。用于植物抗病领域。

主权项

一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：一、将棘孢木霉接种到PDA培养基中进行培养，3天后将孢子用无菌水清洗，接入PDA液体培养基中，28℃培养3天后离心收集菌丝，用Trizol提取菌丝的总RNA，然后用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA；二、以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因EplT4，对目的基因EplT4进行测序鉴定；三、将目的基因EplT4与质粒载体pPIC9K分别经EcoRI和NotI进行双酶切，将酶切后的目的基因EplT4和酶切后的质粒载体pPIC9K连接，构建重组载体pPIC9K‑EplT4；四、将重组载体pPIC9K‑EplT4转化大肠杆菌Top10，挑选转化子进行菌落PCR验证，用质粒提取试剂盒提取阳性转化子的质粒，然后将质粒用SalI酶进行单酶切线性化，并将线性化片段进行回收；五、用毕赤酵母GS115制备毕赤酵母感受态细胞，将线性化片段与毕赤酵母感受态细胞混合，电击转化，获得转化细胞；六、将转化细胞涂在MD平板培养基上，于30℃培养至长出重组菌，将重组菌分别转接到含梯度浓度G418抗生素的MD平板培养基上，于30℃培养，在最高浓度G418抗生素的培养基上生长的菌落，即为毕赤酵母基因工程菌株Pp‑EplT4；其中步骤二中PCR扩增所用上游引物Pa为5′‑CGGAATTCGATACCGTCTCGTACGATACCGGCT‑3′，下游引物Pb为5′‑ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGATGGTGATGGTGATGGAGGCCGCAGTTGCTCACAGC‑3′；步骤四中菌落PCR所用上游引物Pc为5′‑TACTATTGCCAGCATTGCTGC‑3′，下游引物Pd为5′‑GCAAATGGCATTCTGACATCC‑3′。