[发明专利]反转录环介导等温扩增检测禽流感病毒的试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种利用反转录环介导等温扩增技术检测禽流感病毒的试剂盒和方法，本发明通过对禽流感各亚型M基因序列的比对，选出高度保守且特异的核苷酸区域，设计了三对特异性引物，其中所用的外引物分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列；内引物分别含有Seq ID No.3和Seq ID No.4及Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的序列；环引物分别含有Seq ID No.7和Seq ID No.8所示的序列。本发明提供的试剂盒和方法能够特异性地检测出鼻咽拭子、细胞培养液、组织悬液等多种样品中的禽流感病毒，灵敏度高，操作方便快捷。

主权项

一种利用反转录环介导体外等温扩增检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括三对特异性引物、BstDNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液，所述特异性引物包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；所述外引物序列包括F3和B3，F3的序列如SEQ ID NO.1所示，B3的序列如SEQ ID NO.2所示：SEQ ID NO.1：5’‑‑‑CAGATGGTGCAGGCAATGAG‑‑‑3’，SEQ ID NO.2：5’‑‑‑CATCGTCAACATCCACAGCA‑‑‑3’；所述内引物包括前内引物FIP和后内引物BIP，所述前内引物FIP的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4之间通过0～4个碱基相连：SEQ ID NO.3：5’‑‑‑TCACTTGAATCGCTGCA‑‑‑3’；SEQ ID NO.4：5’‑‑‑GCACTCATCCTAGCWCCAGTGCTGG‑‑‑3’；所述后内引物BIP的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6之间通过0～4个碱基相连；SEQ ID NO.5：5’‑‑‑TGCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCG‑‑‑3’，SEQ ID NO.6：5’‑‑‑CCTGCCGATATTCTTCCCTCAT‑‑‑3’；所述环引物包括FLOOP和BLOOP，FLOOP的序列如SEQ ID No.7所示，BLOOP的序列如SED ID NO.8所示：SEQ ID NO.7：5’‑‑‑GCCTGCAAATTTTCAAGAAGATCATC‑‑‑3’，SEQ ID NO.8：5’‑‑‑GGTTTGAAAAGAGGGCCTTCTACG‑‑‑3’；所述试剂盒的反应体系含有10×Bst Buffer 2.5μL、10mM/L的dNTP 3.5μL、25μmol/μL的MgSO4 0.6μL、AIV F3 5pmol、AIV B3 5pmol、40pmol/μL AIV FIP 1μL、40pmol/μL AIV BIP 1μL、25pmol/μL AIV FLOOP 1μL、25pmol/μL AIV BLOOP 1μL、5M甜菜碱5μL、40U/μL RNA酶抑制剂1μL、5U/μL AMV RTase XL 1μL、8U/μLBst DNA聚合酶1μL。