[发明专利]特定肉制品的LAMP法检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明特定肉制品的LAMP法检测试剂盒及检测方法涉及一种用环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测肉品中是否含有某种被测定肉的技术。试剂盒中包括五组相互独立的A型反应液，即反应液A-1、A-2、A-3、A-4、A-5，还包括能与该五组相互独立A型反应液分别反应的反应液B；以及用该试剂盒分别检测牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉、羊肉的方法。优点：本试剂盒根据牦牛、鸡、猪、兔、羊五种肉类的基因分别设计了特异性的两种内引物、两种外引物和两种环引物。使用本发明可快速的对某种肉类或其多种肉混合物制品进行某种肉有无的检测，由于检测速度快，适合作为肉制品掺假的治法工具在基层推广。

主权项

特定肉制品的LAMP法检测试剂盒，包括五组相互独立的A型反应液，该五组相互独立的A型反应液是检测牦牛肉的反应液A‑1、检测鸡肉的反应液A‑2、检测猪肉的反应液A‑3、检测兔肉的反应液A‑4或检测羊肉的反应液A‑5，还包括能与该五组相互独立A型反应液分别反应的反应液B；各反应液的成分和配合比如下：（1）检测牦牛肉的反应液A‑1：每管23.000 μl的组成及配合比如下，2.500 μl 的10×Lamp buffer、1.000 μl 的Bst  DNA聚合酶8U/μl、3.500 μl 的10mM dNTP、 1.000 μl的20μM牦牛肉的内引物1：GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATT‑TTTT‑TAAAGACTAGACCTACAAGTCA、1.000 μl的20μM牦牛肉的内引物2：TAGGGATAACAGCGCAATCCT‑TTTT‑ATGTCCTGATCCAACATCG、0.125 μl的20μM牦牛肉的外引物1：AAAAAATCCTCCGAACGATT、0.125 μl的20μM牦牛肉的内引物2：GATAGCGGTTGCACCATC、0.500 μl的20μM牦牛肉的环引物1：GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、0.500 μl的20μM牦牛肉的环引物2：TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT、4.000 μl 的25mM MgCl2 、4.000 μl 的5M甜菜碱、余量为灭菌蒸馏水；其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X‑100；（2）检测鸡肉的反应液A‑2：每管23.000 μl的组成及配合比如下，2.500 μl 的10×Lamp buffer、1.000 μl 的Bst  DNA聚合酶8U/μl、3.500 μl 的10mM dNTP、 1.000 μl的20μM鸡肉的内引物1：TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGAT‑TTTT‑CCCACTATGCCTAGCCCTA、1.000 μl的20μM鸡肉的内引物2：AACTCTAAGGACTTGGCGGTGC‑TTTT‑GGTGGTTGGGTGAATCGTG、0.125 μl的20μM鸡肉的外引物1：AAAGCTAGGACCCAAACTGG、0.125 μl的20μM鸡肉的内引物2：GGTATGTAGGCTGTGCTGG、0.500 μl的20μM鸡肉的环引物1：TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、0.500 μl的20μM鸡肉的环引物2：CCCAAACCCACCTAGAGGAG、4.000 μl 的25mM MgCl2 、4.000 μl 的5M甜菜碱、余量为灭菌蒸馏水；其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X‑100；（3）检测猪肉的反应液A‑3：每管23.000 μl的组成及配合比如下，2.500 μl 的10×Lamp buffer、1.000 μl 的Bst  DNA聚合酶8U/μl、3.500 μl 的10mM dNTP、 1.000 μl的20μM猪肉的内引物1：CAGGCTCCTCTAGGTGGATG‑TTTT‑TCGCAACTGCCTAAAACTC、1.000 μl的20μM猪肉的内引物2：TCGATAAACCCCGATAGACCTT‑TTTT‑TAGGGTTTGCTGAAGATGG、0.125 μl的20μM猪肉的外引物1：CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、0.125 μl的20μM猪肉的内引物2：ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT、0.500 μl的20μM猪肉的环引物1：AGCACCGCCAAGTCCTTT、0.500 μl的20μM猪肉的环引物2：CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT、4.000 μl 的25mM MgCl2 、4.000 μl 的5M甜菜碱、余量为灭菌蒸馏水；其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X‑100；（4）检测兔肉的反应液A‑4：每管23.000 μl的组成及配合比如下，2.500 μl 的10×Lamp buffer、1.000 μl 的Bst  DNA聚合酶8U/μl、3.500 μl 的10mM dNTP、 1.000 μl的20μM兔肉的内引物1：GGAAGGCTATGTCAGGAGCC‑TTTT‑TATAATTGGAGGCTTCGGGA、1.000 μl的20μM兔肉的内引物2：CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCT‑TTTT‑GGTGGATAAACAGTTCAGC、0.125 μl的20μM兔肉的外引物1：ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT、0.125 μl的20μM兔肉的内引物2：GCATGTGCAAGATTACCG、0.500 μl的20μM兔肉的环引物1：TGACCGAACAGGGGGACT、0.500 μl的20μM兔肉的环引物2：AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA、4.000 μl 的25mM MgCl2 、4.000 μl 的5M甜菜碱、余量为灭菌蒸馏水；其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X‑100；（5）检测羊肉的反应液A‑5：每管23.000 μl的组成及配合比如下，2.500 μl 的10×Lamp buffer、1.000 μl 的Bst  DNA聚合酶8U/μl、3.500 μl 的10mM dNTP、 1.000 μl的20μM羊肉的内引物1：ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAA‑TTTT‑CCGGTTTTATCCACTAACAGAA、1.000 μl的20μM羊肉的内引物2：TATGCGCCCTCACCCAAAAT‑TTTT‑TTACTATTATGAGGCCGAGTT、0.125 μl的20μM羊肉的外引物1：AGCAGGCATCTTCCTACT、0.125 μl的20μM羊肉的内引物2：GGGGTTGATTAATTCCGATTG、0.500 μl的20μM羊肉的环引物1：GTTATTTAAACCGGTTAG、0.500 μl的20μM羊肉的环引物2：AATTATCGCTT TCTCTACATC CAGC、4.000 μl 的25mM MgCl2 、4.000 μl 的5M甜菜碱、余量为灭菌蒸馏水；其中，10×Lamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8、 100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X‑100；（6）反应液B：1000×的荧光染料 SYBR Green Ⅰ。