[发明专利]一种小鼠淋巴细胞诱变方法

摘要

本发明公开了一种小鼠淋巴细胞诱变方法，包括以下步骤：（1）淋巴细胞的分离；（2）小鼠ES细胞的培养；（3）淋巴细胞与ES细胞的融合；（4）诱变细胞的分离培养。淋巴细胞作为动物机体内的一种重要组成细胞，具有来源广泛、取材方面等优点，本发明借助细胞融合技术诱导小鼠淋巴细胞转变形成干细胞，形成的干细胞具有小鼠ES细胞的形态、基因表达、体外分化能力等特征，有效避免了病毒在干细胞诱导中的潜在危害。因此，该方法将为小鼠体细胞转变成干细胞并得到广泛应用奠定基础，同时，也为动物或人类的干细胞研究和利用提供重要借鉴。

主权项

一种小鼠淋巴细胞诱变方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）淋巴细胞的分离取绿色荧光蛋白转基因小鼠，绿色荧光蛋白转基因小鼠为商品化转基因小鼠，颈部脱臼处死，酒精腹部消毒，在无菌条件下打开腹腔，取出小鼠脾脏，PBS液洗涤后，在200目尼龙网膜内轻轻研磨形成单个细胞，并经PBS液洗涤后收集，离心去上清液，用无血清DMEM培养液重悬备用；（2）小鼠ES细胞的培养取12.5 天小鼠胎儿成纤维细胞用高糖DMEM培养液进行培养，待细胞铺满培养皿后，用含2.5 mg/ml胰酶‑0.2mg/ml EDTA的细胞消化液消化传代培养，取铺满培养皿的胎儿成纤维细胞用10 μg/ml的丝裂霉素作用2.5 小时，用含2.5 mg/ml胰酶‑0.2 mg/ml EDTA的细胞消化液消化后接种至0.1%明胶处理的培养皿上于培养箱中进行培养，取接种后第3天均匀铺满培养皿的细胞用作饲养层；小鼠ES细胞R1细胞系为商品化细胞系，取第26代小鼠ES细胞R1细胞系接种到小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培养液进行培养，小鼠ES细胞每两天传代一次；（3）淋巴细胞与ES细胞的融合用含2.5 mg/ml胰酶‑0.2 mg/ml EDTA的细胞消化液消化小鼠ES细胞，收集离心去上清液，用无血清DMEM培养液重悬，把小鼠淋巴细胞与ES细胞按1：2~10比例进行混匀，离心去上清液，用50%PEG溶液进行作用90秒，无血清DMEM培养液稀释重选，离心去上清液，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培养液，接种细胞于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行培养；（4）诱变细胞的分离培养培养2天后，荧光显微镜下选择表达绿色荧光蛋白的细胞集落，在显微镜下分选细胞克隆集落，接种到新的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培养液进行培养，细胞集落在饲养层上生长2天后，用含2.5 mg/ml胰酶‑0.2 mg/ml EDTA的细胞消化液消化细胞集落，重新接种细胞于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行扩增培养。